प्रतिदीप्ति डीएनए के लिए सरल तरीका<em> बगल में</em> कुचल गुणसूत्रों को संकरण
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
सीटू संकरण (डीएनए ISH) में डीएनए विशिष्ट गुणसूत्र क्षेत्रों के लिए मानचित्रण दृश्यों के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि है। यह दृष्टिकोण कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण निषेधात्मक चुनौतियों का सामना करना पड़ता है, जहां heterochromatic क्षेत्रों को मानचित्रण अत्यधिक दोहराए दृश्यों में विशेष रूप से प्रभावी है। यहाँ हम अन्य डीएनए ISH प्रोटोकॉल में मानक कदम उठाए हैं कि formamide washes के circumvents कि डीएनए ISH के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन है। हमारी प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से विभिन्न कीट प्रकार के ऊतकों की एक संख्या भर heterochromatic गुणसूत्र क्षेत्रों के भीतर दोहराए डीएनए दृश्यों के निशान जो फ्लोरोसेंट रंजक, ले जाने के लिए है कि कम भी कतरा डीएनए जांच के साथ संकरण के लिए अनुकूलित है। हालांकि, अनुप्रयोगों बड़ा जांच और भी कॉपी (गैर दोहराए) डीएनए दृश्यों के दृश्य के साथ उपयोग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। हम तंत्रिका कोशिकाओं और Nasonia मेलानोगास्टर ड्रोसोफिला से कुचल गुणसूत्रों के लिए कई अलग अलग दोहराए दृश्यों मानचित्रण द्वारा इस विधि का प्रदर्शनvitripennis spermatocytes। हम दोनों छोटे, व्यावसायिक रूप से संश्लेषित जांच के लिए और तुलना के लिए एक बड़ा जांच के लिए संकरण पैटर्न दिखा। यह प्रक्रिया सरल प्रयोगशाला की आपूर्ति और अभिकर्मकों का उपयोग करता है, और डीएनए ISH के प्रदर्शन के साथ कम अनुभव है जो जांचकर्ताओं के लिए आदर्श है।
Introduction
सीटू संकरण (डीएनए ISH) में डीएनए विशिष्ट गुणसूत्र क्षेत्रों के लिए मानचित्रण दृश्यों के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि है। Euchromatin भीतर भी कॉपी क्षेत्रों के लिए जांच की एक विस्तृत विविधता के माध्यम से निक-अनुवाद या लंबी डीएनए उत्पादों 1,2 के अंत लेबलिंग और deoxygenin (डीआईजी) का समावेश सहित दृष्टिकोण, -attached न्यूक्लियोटाइड और उनकी मान्यता के एक मुट्ठी के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है समूह संयुग्मित एंटीबॉडी 1-3। कुछ या एकल प्रतिलिपि संख्या में euchromatic दृश्यों के दृश्य उच्च विशिष्ट गतिविधि या सामूहिक रूप से संकेत बढ़ाने कि कई छोटे, जांच की एक कॉकटेल के साथ ही, बड़ी जांच या तो के उपयोग की आवश्यकता है।
वे सामान्य रूप से दसियों ब्लॉक के रूप में जाना जाता है एक गुणसूत्र क्षेत्रों में क्लस्टर दोहराता के हजारों करने के रूप में मौजूद हैं, क्योंकि इसके विपरीत, ऐसे उपग्रह DNAs रूप heterochromatin में पाया अत्यधिक दोहराए दृश्यों, डीएनए ISH के लिए आसान लक्ष्य कर रहे हैं। Transposable तत्वों को भी हो सकता हैअलग गुणसूत्र loci 2 पर उच्च प्रतिलिपि संख्या में पाया। इन मामलों में, कम विशिष्ट गतिविधि के साथ ही जांच को प्रभावी ढंग से की वजह से कई साइटों पर उनके संकरण करने heterochromatic दृश्यों लेबल कर सकते हैं। दोहराए दृश्यों के लिए जांच व्यावसायिक रूप के रूप में कम oligonucleotides (30-50 बीपी) संश्लेषित और रासायनिक कई अलग फ्लोरोसेंट समूहों में से किसी के साथ संयुग्मित किया जा सकता है। जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके heterochromatin भीतर दोहराए दृश्यों का मिलान होने के कारण अत्यधिक दोहराए उपग्रह ब्लॉक 4-6,7 भीतर इमारत scaffolds में सामना करना पड़ा चुनौतियों के लिए मुश्किल है। वर्तमान में, ISH के उप-गुणसूत्र के स्तर पर इन दृश्यों मानचित्रण का सबसे प्रभावी तरीके के रूप में खड़ा है। इस रणनीति चल रही जीनोम और transcriptome अनुक्रमण पढ़ाई का पर्दाफाश किया जा रहा है कि दोहराए दृश्यों की बड़ी संख्या मानचित्रण के लिए महत्वपूर्ण है।
स्लाइड पर चढ़कर गुणसूत्रों पर मानचित्रण दोहराए दृश्यों की दक्षता और आसानी जीआरई की जाएगीatly डीएनए ISH के लिए एक सरल प्रोटोकॉल के द्वारा बढ़ाया। उदाहरण के लिए, डीएनए ISH के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल इस प्रकार मानचित्रण दृश्यों के लिए आवश्यक समय के लिए काफी हद तक जोड़ने और भी महंगा इस अभिकर्मक के लिए रासायनिक कचरे के बड़ी मात्रा में उत्पादन होता है, formamide समाधान 2,8 में संकरित ऊतकों के कई washes के शामिल है। यहाँ हम formamide washes के लिए की जरूरत में गतिरोध उत्पन्न करने और बुनियादी प्रयोगशाला के उपकरण और अभिकर्मकों इस्तेमाल करता है कि एक संशोधित डीएनए ISH विधि का वर्णन। इस विधि के मूल प्रतिदीप्ति रंगों के साथ संयुग्मित कर रहे हैं कि व्यावसायिक रूप से संश्लेषित oligos का उपयोग करके ड्रोसोफिला लार्वा neuroblasts के heterochromatic क्षेत्रों में अत्यधिक दोहराए डीएनए दृश्यों का तेजी से मानचित्रण के लिए डिजाइन किया गया था। हालांकि, इस विधि को भी अन्य साधन 9,10 के माध्यम से और कई अलग ऊतक और गुणसूत्र प्रकार भर में संश्लेषित बड़ा जांच का उपयोग करके दोहराए दृश्यों मानचित्रण के लिए काम करता है। साथ ही, इस विधि लंबे समय तक या multip का उपयोग करके euchromatic दृश्यों नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैLe, ब्याज की euchromatic अनुक्रम में कम जांच।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए ISH अक्सर गुणसूत्रों के लिए विशिष्ट दृश्यों नक्शा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम उच्च प्रतिलिपि संख्या, heterochromatic दृश्यों के लिए अनुकूलित डीएनए ISH के लिए एक सरल विधि का वर्णन किया है। बल्कि अन्य मौ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
References
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