A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

Resumo

A eletroporação foi usada para inserir proteínas efetoras de virulência bacteriana purificadas diretamente em células eucarióticas vivas. A localização das proteínas foi monitorada por microscopia de imunofluorescência confocal. Este método permite estudos sobre tráfego, função e interações proteína-proteína usando proteínas exógenas ativas, evitando a necessidade de expressão heteróloga em células eucarióticas.

Resumo

O estudo das interações proteína no contexto de células vivas podem gerar informações importantes sobre a localização, dinâmica e parceiros interagem. Esta informação é particularmente valiosa no contexto das interacções hospedeiro-agente patogénico. Muitas proteínas de agentes patogénicos funcionar dentro das células hospedeiras na forma de uma variedade tais como, permitindo a evasão do sistema imunitário do hospedeiro e a sobrevivência no ambiente intracelular. Para estudar essas interações célula-hospedeiro de patógenos em proteínas, diversas abordagens são comumente usados, incluindo: infecção in vivo com uma estirpe que expressa uma proteína marcada ou mutante, ou a introdução de genes de patógenos via transfecção ou transdução. Cada uma destas abordagens tem vantagens e desvantagens. Buscamos um meio para introduzir directamente proteínas exógenas nas células. A electroporação é geralmente utilizado para introduzir ácidos nucleicos em células, mas foi mais raramente aplicado a proteínas, embora a base biofísica é exactamente o mesmo.Um electroporador padrão foi utilizada para introduzir efectores bacterianas de afinidade marcado com em células de mamífero. Macrófagos epiteliais e mouse Humanos foram cultivados pelos métodos tradicionais, individual, e colocados em 0,4 centímetros cuvetes gap eletroporação com uma proteína exógena bacteriana patógeno de interesse (por exemplo, Salmonella Typhimurium GTGE). Após a eletroporação (0,3 kV) e um curto período de recuperação (4 horas), proteína intracelular foi verificada por fluorescently rotulando a proteína através da sua marca de afinidade e examinar a distribuição espacial e temporal por microscopia confocal. A proteína também electroporação mostrou ser funcional no interior da célula e capaz de tráfico subcelular correcta e interacção proteína-proteína. Enquanto as proteínas exógenas tendia a acumular-se sobre a superfície das células, as amostras electroporadas teve grandes aumentos na concentração intracelular de efector em relação à incubação sozinho. O protocolo é simples e rápido o suficiente para ser feito em apmoda arallel, permitindo a caracterização de alta taxa de transferência de proteínas de patógenos em células hospedeiras incluindo segmentação e função das proteínas de virulência subcelular.

Introdução

Muitas bactérias Gram-negativas empregam sistemas de secreção especializados para injetar proteínas relacionadas à virulência (referidas como efetores) diretamente nas células hospedeiras ^1-5. Estes efectores têm uma ampla gama de funções biológicas, incluindo: supressão da imunidade do hospedeiro, alterações do citoesqueleto, a modificação do tráfico intracelular e de sinalização, alterações da transcrição, e as alterações de proteassoma hospedeiro ^6-9. As funções de alguns efectores são conhecidos, no entanto, os alvos do hospedeiro e de acção bioquímica (s) de muitos outros permanece a ser determinada. Ao se comparar o tipo selvagem e infecçõ....

Protocolo

1. Prepare-se com antecedência

1. Quente fosfato estéril salina tamponada (PBS) a 37 ° C.
2. Modificação de Dulbecco quente de Meio de Eagle (DMEM) e Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C. Nota: Estes representam crescimento normal de mídia (NGM) para as células RAW e HeLa, respectivamente.

2. Preparação de Células

1. Crescer 264.7 RAW para 70-90% de confluência em NGM.
   1. Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 95% de ar / 5% de _CO2.
2. Cultivar célula....

Resultados

Como um teste de conceito, a proteína fluorescente verde purificada foi introduzida com sucesso em células de mamíferos utilizando eletroporação. GFP, um valor aproximado de 27 kD, uma proteína de peso molecular é geralmente introduzido nas células de mamífero (normalmente expressos a partir de ADN de plasmídeo), como uma ferramenta de biologia molecular, sem toxicidade celular significativa. As células HeLa foram incubadas (Figura 1A) ou electroporação (Figura 1B) com 25 ug / ml de GFP.......

Discussão

Efectores secretadas a partir de bactérias patogénicas evoluíram a funcionar dentro do ambiente da célula hospedeira e, assim, é útil para estudá-los in situ dentro do hospedeiro. Introdução de efetores específicos de interesse em células hospedeiras permite a interação patógeno-hospedeiro relevantes a serem estudados de forma isolada, sem a interferência de outras proteínas bacterianas. O objectivo foi o de explorar a electroporação como um meio para introduzir proteínas efectoras bacterianas em células hosped.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de Tripsina-EDTA a 0,25%	Cellgro	25-050-Cl
0,4 cm Cubetas de eletroporação descartáveis	Bio-Rad	165-2088
100% Metanol	Qualquer	N/A
Albumina de soro bovino inflamável e tóxica (BSA)	Aparelho de contagem de células Sigma-Aldrich	A4919
- Hemocitômetro ou contador de relhas	Beckman Coulter	Incubadora de Cultura de Células Modelo Z1
	Qualquer	N/A	Umidificado 95% ar/5% CO2 atmosfera a 37 ° C
Plástico de cultura de células	Qualquer	N/A	Frascos de cultura de células/placas, pipetas, tubos, borracha Modificação
do Eagle do policial Dulbecco' s Médio (DMEM)	Cellgro	10-013	Quente a 37 &graus; C
Electroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Microscópio confocal fluorescente	Modelo Ziess	LSM 710
Pratos de Fundo de Vidro para Microscopia	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Inibidor de Protease Cocktail	Pierce	78430	Linha
Celular HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Buffer de Carregamento	Invitrogen	NP0007
Meio Essencial Mínimo (MEM)	Cellgro	10-010	Quente para 37 ° C
Outras colorações fluorescentes (WGA, DAPI) em conjunto com reagente anti-desbotamento	Qualquer	N/A
Penicilina/Estreptomicina	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Linha celular	ATCC	TIB-71
Anticorpo primário contra alvo de interesse	Qualquer	N/A
Anticorpo secundário conjugado ao fluoróforo	Qualquer	N/A
solução salina tamponada com fosfato	qualquer	resfriamento N / A	a 4 ° C
Fosfato estéril tamponado com solução salina	Qualquer	N/A	quente a 37 &graus; C
[header]
Streptavidin Suspensão de Resina de Agarose	Perfure	20353
Centrífuga de mesa capaz de aceitar tubos cônicos (balde oscilante preferido)	Qualquer	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	corrosivo, tóxico
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	irritante, tóxico

Corrosiva e Tóxica