Elektroporation af funktionelle Bakterielle effektorer i pattedyrceller

Summary

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Abstract

Studiet af protein-interaktioner i forbindelse med levende celler kan generere kritiske oplysninger om lokalisering, dynamik og interagerende partnere. Denne information er især værdifuldt i forbindelse med vært-patogen interaktioner. Mange patogene proteiner fungerer inden værtsceller i en række måde, såsom muliggør omgåelse af værtens immunsystem og overlevelse i det intracellulære miljø. For at undersøge disse patogen-protein vært-celle-interaktioner er flere metoder almindeligt anvendt, herunder: in vivo infektion med en stamme, der udtrykker et mærket eller mutant protein, eller indførelse af patogene gener via transfektion eller transduktion. Hver af disse metoder har fordele og ulemper. Vi søgte et middel til direkte at indføre exogene proteiner i celler. Elektroporation er almindeligt anvendt til at indføre nucleinsyrer i celler, men er mere sjældent anvendt til proteiner selvom biofysiske grundlag er nøjagtig den samme.En standard elektroporator blev anvendt til at indføre affinitetsmærkede bakterielle effektorer i pattedyrceller. Humane epitelceller og muse makrofag celler blev dyrket ved traditionelle metoder, fritstående, og anbringes i 0,4 cm hul elektroporation kuvetter med et exogent bakterielt patogen proteinet af interesse (f.eks Salmonella Typhimurium GtgE). Efter elektroporation (0,3 kV) og en kort (4 timer) tilbagebetalingsperioden blev intracellulært protein verificeret ved fluorescens mærkning af protein via dets affinitet tag og undersøge rumlige og tidsmæssige fordeling af konfokal mikroskopi. Den elektroporerede protein blev også vist at være funktionel inde i cellen og i stand til korrekt subcellulær handel og protein-protein-interaktion. Mens de eksogene proteiner tendens til at akkumulere på overfladen af ​​cellerne, den elektroporerede prøver havde store stigninger i intracellulær effektor koncentration i forhold til inkubation alene. Protokollen er enkel og hurtig nok til at ske i aparallel mode, der giver mulighed for high-throughput karakterisering af patogene proteiner i værtsceller herunder subcellulær målretning og funktion af virulens proteiner.

Introduction

Mange Gram-negative bakterier anvender specialiserede sekretionssystemer at injicere virulens-relaterede proteiner (benævnt effektorer) direkte i værtsceller ^1-5. Disse effektorer har en bred vifte af biologiske funktioner, herunder: undertrykkelse af vært immunitet, cytoskeletale ændringer, ændring af intracellulær handel og signaler, transkriptionelle ændringer, og vært proteasom ændringer ^6-9. Funktionerne af nogle effektorer kendes dog værten mål og biokemisk virkning (er) af mange andre er endnu ikke fastslået. Mens sammenligne vildtype og rekombinante bakterielle infektioner er en gyldig metode til at undersøge intracellulære effektor virulens mekanismer, er det ofte fordelagtigt at indføre en enkelt effektor i værtscellen. Således enkle metoder til indføring og karakterisering bakterielle effektor proteiner i forbindelse med værtsceller er særdeles ønskelig.

Forenkling af eksperimentel analyse with en enkelt effektor er kritisk, da andre effektorer kan have modstående eller overflødige funktioner. For at opnå denne forenkling har forskere tidligere indført makromolekyler i celler ved mange forskellige metoder, herunder viral transduktion ^10, mikroinjektion ^11, skrabe lastning ^12,13, cellefusion med kemisk induceret mikroinjektion ^14, proprietær protein "transfektion" reagenser ^15, calciumphosphat nedbør ¹⁶ og elektroporation ^17-20. De indførte molekyler spænder fra nukleinsyrer, herunder DNA, RNA og RNAi arter til proteiner, celleimpermeable farvestoffer og antistoffer til intracellulære mål ^21,22. Nogle metoder har begrænsninger, herunder den type makromolekyle der kan indføres, og især downstream analyser kan være begrænset på grund af høj cellulær toksicitet, skadelige virkningsmekanismer, lav effekt, eller introduktion effektivitet. Transfektion en oftenn-anvendte metode til ekspression af bakterielle gener i mammale celler, også lider den begrænsning, at nogle relevante vært celletyper, såsom makrofager og primære celler, er særligt modstandsdygtig overfor transfektion. Ud over dette er det vanskeligt at kontrollere niveauet af bakteriel protein produceret ved indføring af fremmed DNA.

Meget arbejde har etableret elektroporation af nukleinsyrer i både bakterie- og pattedyrsceller som en fælles laboratorium teknik; Men der er igangværende forskning i de bedste metoder til at levere proteiner i celler under fysiologiske betingelser. Rapporter om protein transfektion er lovende, men kræver dyre reagenser og optimering. Ønsket om at indføre potentielt toksiske bakterielle effektorer i en lang række celle- mål med minimale omkostninger førte os til at overveje elektroporering som en fremgangsmåde til at studere disse proteiner in vivo.

Protein elektroporation ^23-25 ​​er et opfyldthod at indføre proteiner i levende celler via electropermeabilization, også kendt som elektro-transfektion eller elektro-injektion ^26. Denne teknik anvender højintensive elektriske impulser til at skabe porer i cellemembraner. Disse reversible porer tillader makromolekyler, der normalt er udelukket fra intracellulære rum at komme ind i cellen. Efter fjernelse af det ydre elektrisk felt kan membranen genforsegle, tillader cellen at fastholde molekyler, der passerede gennem porerne ^27,28.

En standard elektroporator blev anvendt i denne undersøgelse konsekvent indføre bakterielle effektorer i både mus makrofag-lignende celler og humane epitelceller. Metoden er hurtig, effektiv og billig, med nogen mærkbar nedgang i cellulær levedygtighed. De indførte proteiner kan visualiseres via immunfluorescensmikroskopi eller anvendes til funktionelle assays. Dette er blevet påvist ved anvendelse af grønt fluorescerende protein (GFP) som en ikke-toksisk standard, samtto Salmonella effektor proteiner, SspH1 og GtgE. Vi foreslår protein elektroporation som et supplerende redskab i repertoiret for studiet af bakterielle virulens proteiner og deres funktioner i eukaryote værtsceller.

Protocol

1. Forbered i Advance Varm sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) til 37 ° C. Varm Dulbeccos modifikation af Eagles medium (DMEM) og Minimal Essential Medium (MEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 IU / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin til 37 ° C. Bemærk: Disse repræsenterer Normal vækstmedier (NGM) for RAW og HeLa-celler hhv. 2. Fremstilling af celler Grow RAW 264.7-celler til 70-90% konfluens i NGM. Oprethold celle…

Representative Results

Som et indledende proof of concept, blev renset grønt fluorescerende protein med succes indført i pattedyrceller ved anvendelse af elektroporation. GFP, en omtrentlig 27 kD en molekylvægt protein er almindeligt indføres i pattedyrceller (normalt udtrykt fra plasmid-DNA) som et molekylærbiologisk værktøj uden signifikant cellulær toksicitet. HeLa-celler blev inkuberet (figur 1A) eller elektroporeret (figur 1B) med 25 ug / ml GFP efterfulgt af immunofluorescens konfokal mikroskopi…

Discussion

Secernerede effektorer fra patogene bakterier har udviklet sig til at fungere i værtscellen miljø og det er således nyttigt at studere dem in situ i værten. Indførelse af specifikke effektorer af interesse i værtsceller tillader det relevante patogen-værts interaktioner skal undersøges isoleret uden indblanding fra andre bakterielle proteiner. Målet var at undersøge elektroporation som et middel til at indføre bakterielle effektor proteiner i eukaryote værtsceller og derved undgå nogle af de udford…

Materials

Material or Equipment	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Cellgro	25-050-Cl
0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2088
100% Methanol	Any	N/A	Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter	Beckman Coulter	Model Z1
Cell Culture Incubator	Any	N/A	Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C
Cell Culture Plastic	Any	N/A	Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM)	Cellgro	10-013	Warm to 37 °C
Electroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Fluorescent confocal microscope	Ziess	Model  LSM 710
Glass Bottom Dishes for Microscopy	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail	Pierce	78430	Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer	Invitrogen	NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)	Cellgro	10-010	Warm to 37 °C
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent	Any	N/A
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line	ATCC	TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest	Any	N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore	Any	N/A
Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Chill to 4 °C
Sterile Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Warm to 37 °C
Streptavidin Agarose Resin Suspension	Pierce	20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)	Any	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	Corrosive, Toxic
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Irritant, Toxic