स्तनधारी कोशिकाओं में कार्यात्मक बैक्टीरियल effectors के electroporation
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
जीवित कोशिकाओं के संदर्भ में प्रोटीन बातचीत का अध्ययन स्थानीयकरण, गतिशीलता, और बातचीत भागीदारों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी उत्पन्न कर सकते हैं। यह जानकारी मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के संदर्भ में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। कई रोगज़नक़ प्रोटीन इंट्रासेल्युलर पर्यावरण के भीतर मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली और अस्तित्व की चोरी, सक्रिय करने के लिए इस तरह के रूप में जिस तरह की एक किस्म में मेजबान कोशिकाओं के भीतर कार्य करते हैं। इन रोगज़नक़ प्रोटीन मेजबान सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए, कई दृष्टिकोण सामान्यतः सहित उपयोग किया जाता है: विवो संक्रमण में अभिकर्मक या पारगमन के माध्यम से एक टैग या उत्परिवर्ती प्रोटीन, या रोगज़नक़ जीन की शुरूआत व्यक्त तनाव के साथ। इन तरीकों में से प्रत्येक के फायदे और नुकसान है। हम सीधे कोशिकाओं में बहिर्जात प्रोटीन को पेश करने का एक साधन की मांग की। Electroporation सामान्यतः कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन biophysical आधार बिल्कुल वैसा ही है, हालांकि अधिक शायद ही कभी प्रोटीन के लिए लागू किया गया है।एक मानक electroporator स्तनधारी कोशिकाओं में आत्मीयता टैग बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मानव उपकला और माउस मैक्रोफेज कोशिकाओं, पारंपरिक तरीकों से सुसंस्कृत अलग है, और ब्याज की एक बहिर्जात बैक्टीरियल रोगज़नक़ प्रोटीन (जैसे साल्मोनेला GtgE) के साथ 0.4 सेमी के अंतराल electroporation के cuvettes में रखा गया था। Electroporation के (0.3 केवी) और एक छोटी (4 घंटा) वसूली की अवधि के बाद, intracellular प्रोटीन fluorescently अपनी आत्मीयता टैग के माध्यम से प्रोटीन लेबलिंग और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा स्थानिक और लौकिक वितरण की जांच से सत्यापित किया गया था। electroporated प्रोटीन भी सेल के अंदर कार्यात्मक और सही subcellular तस्करी और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत करने में सक्षम होने के लिए दिखाया गया था। बहिर्जात प्रोटीन कोशिकाओं की सतह पर जमा हो जाती थी, वहीं electroporated नमूने अकेले ऊष्मायन के लिए इंट्रासेल्युलर प्रेरक एकाग्रता सापेक्ष में बड़े बढ़ जाती थी। प्रोटोकॉल एपी में किया जा करने के लिए सरल और तेजी से पर्याप्त हैsubcellular लक्ष्यीकरण और डाह प्रोटीन के समारोह सहित मेजबान कोशिकाओं में रोगज़नक़ प्रोटीन की उच्च throughput लक्षण वर्णन के लिए अनुमति arallel फैशन,।
Introduction
कई ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया सीधे मेजबान कोशिकाओं 1-5 में (प्रभावोत्पादक के रूप में करने के लिए कहा गया है) डाह से संबंधित प्रोटीन इंजेक्षन करने के लिए विशेष स्राव सिस्टम को रोजगार। मेजबान उन्मुक्ति का दमन, cytoskeletal परिवर्तन, intracellular तस्करी और संकेतन, ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन के संशोधन, और मेजबान Proteasome परिवर्तन 6-9: इन प्रभावोत्पादक सहित जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला है। कुछ effectors के कार्यों हालांकि मेजबान लक्ष्य और कई अन्य लोगों के जैव रासायनिक क्रिया (ओं) निर्धारित किया जाना बना रहता है, जाना जाता है। जंगली प्रकार और पुनः संयोजक बैक्टीरिया के संक्रमण की तुलना इंट्रासेल्युलर प्रेरक डाह तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक वैध दृष्टिकोण है, यह मेजबान सेल में एक व्यक्ति प्रेरक लागू करने के लिए अक्सर फायदेमंद है। इस प्रकार, मेजबान कोशिकाओं के संदर्भ में बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन शुरू करने और निस्र्पक के लिए सरल तरीकों अत्यधिक वांछनीय है।
प्रयोगात्मक विश्लेषण वाई सरल बनानेएक भी प्रेरक महत्वपूर्ण है वें अन्य प्रभावोत्पादक विरोध या अनावश्यक कार्यों में हो सकता है के रूप में। इस सरलीकरण को पूरा करने के लिए, शोधकर्ताओं ने पहले से नोच 12,13 लोड हो रहा है, वायरल पारगमन 10, microinjection के 11 सहित कई अलग अलग तरीकों, द्वारा कोशिकाओं में बड़े अणुओं पेश किया है, रासायनिक प्रेरित microinjection के 14, मालिकाना प्रोटीन "अभिकर्मक" अभिकर्मकों 15, कैल्शियम फास्फेट precipitations के साथ सेल संलयन 16, और electroporation 17-20। शुरू की अणुओं इंट्रासेल्युलर लक्ष्य 21,22 के लिए प्रोटीन, सेल अभेद्य रंजक, और एंटीबॉडी के लिए डीएनए, आरएनए, और आरएनएआई प्रजातियों सहित न्यूक्लिक एसिड से लेकर। कुछ तरीकों पेश किया जा सकता है कि macromolecule के प्रकार सहित सीमाएं हैं, और विशेष रूप से नीचे की ओर विश्लेषण के कारण उच्च सेलुलर विषाक्तता, कार्रवाई के हानिकारक तंत्र, कम प्रभावकारिता, या परिचय दक्षता के लिए सीमित हो सकती है। अभिकर्मक, एक ofteभी ऐसे मैक्रोफेज और प्राथमिक कोशिकाओं के रूप में कुछ प्रासंगिक मेजबान सेल प्रकार, अभिकर्मक की ओर विशेष रूप से प्रतिरोधी रहे हैं कि सीमा ग्रस्त है, स्तनधारी कोशिकाओं में बैक्टीरियल जीन व्यक्त करने के लिए विधि एन इस्तेमाल किया। इस के अलावा, यह विदेशी डीएनए की शुरूआत पर उत्पादित बैक्टीरियल प्रोटीन के स्तर को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है।
ज्यादा काम एक आम प्रयोगशाला तकनीक के रूप में दोनों बैक्टीरिया और स्तनधारी कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड की electroporation की स्थापना की है; हालांकि, शारीरिक शर्तों के तहत कोशिकाओं में प्रोटीन देने के लिए सर्वोत्तम तरीकों में चल रहे अनुसंधान नहीं है। प्रोटीन अभिकर्मक पर रिपोर्ट वादा कर रहे हैं, लेकिन महंगा अभिकर्मकों और अनुकूलन की आवश्यकता है। न्यूनतम लागत के साथ सेल लक्ष्यों की एक विस्तृत विविधता में संभावित विषाक्त बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक शुरू करने की इच्छा vivo में इन प्रोटीनों के अध्ययन के लिए एक विधि के रूप में electroporation पर विचार करने के लिए हमें का नेतृत्व किया।
प्रोटीन electroporation के 23-25 एक मुलाकात की हैयह भी विद्युत अभिकर्मक या विद्युत इंजेक्शन 26 के रूप में जाना electropermeabilization के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन को पेश करने का HOD। इस तकनीक को कोशिका झिल्ली में pores बनाने के लिए उच्च तीव्रता विद्युत दालों का उपयोग करता है। ये प्रतिवर्ती pores के सामान्य रूप से intracellular अंतरिक्ष से बाहर रखा गया है कि बड़े अणुओं सेल में प्रवेश करने की अनुमति देते हैं। बाहरी बिजली के क्षेत्र के हटाने पर, झिल्ली सेल pores, 27,28 के माध्यम से पारित कर दिया है कि अणुओं को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है, reseal कर सकते हैं।
एक मानक electroporator लगातार माउस मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह है और मानव उपकला कोशिकाओं दोनों में बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक लागू करने के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। विधि सेलुलर व्यवहार्यता में कोई सराहनीय कमी के साथ, त्वरित, कुशल और सस्ती है। शुरू की प्रोटीन immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कल्पना या कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस के साथ ही, एक गैर विषैले मानक के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया हैदो साल्मोनेला प्रेरक प्रोटीन, SspH1 और GtgE। हम यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरियल विषैलापन प्रोटीन और उनके कार्यों के अध्ययन के लिए प्रदर्शनों की सूची में एक अतिरिक्त उपकरण के रूप में प्रोटीन electroporation के प्रस्ताव।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोगजनक बैक्टीरिया से स्रावित प्रभावोत्पादक मेजबान सेल पर्यावरण के भीतर कार्य करने के लिए विकसित किया है और इस तरह यह मेजबान भीतर बगल में उन्हें अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। मेजबान कोशिकाओं में ब?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
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