الحث المباشر من العصبية الإنسان الخلايا الجذعية من خلايا الدم المحيطي المكونة للدم السلف
Summary
وقد تم تطوير طريقة لاستخلاص مباشرة الخلايا الجذعية العصبية البشرية من الخلايا الاصلية المكونة للدم التخصيب من خلايا الدم الطرفية.
Abstract
الأمراض التي تصيب البشر الثقافات العصبية محددة ضرورية لتوليد نماذج في المختبر للأمراض العصبية البشرية. ومع ذلك، فإن عدم الوصول إلى الكبار البشري الثقافات العصبية الأولية يثير تحديات فريدة من نوعها. التطورات الأخيرة في الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (IPSC) توفر نهجا بديلا لاستخلاص الثقافات العصبية من الخلايا الليفية الجلد من خلال المريض IPSC محددة، ولكن هذه العملية كثيفة العمالة، ويتطلب خبرة خاصة وكميات كبيرة من الموارد، ويمكن أن يستغرق عدة أشهر. هذا يمنع تطبيق واسع لهذه التكنولوجيا لدراسة الأمراض العصبية. للتغلب على بعض من هذه القضايا، وقد وضعنا طريقة لاستخلاص الخلايا الجذعية العصبية مباشرة من الكبار البشري الدم المحيطي، وتجاوز عملية الاشتقاق IPSC. كانت الخلايا الاصلية المكونة للدم المخصب من الكبار البشري الدم المحيطي المستزرعة في المختبر، وtransfected مع ناقلات فيروس سينداي التي تحتوي على عوامل النسخي Sox2 أكتوبر3/4، Klf4، وج. Myc على. نتائج ترنسفكأيشن في تغيرات شكلية في الخلايا التي يتم اختيارها مزيد باستخدام البشري المتوسطة السلف العصبية التي تحتوي على عامل أساسي نمو الخلايا الليفية (bFGF) وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). وتتميز الخلايا الناجم عن ذلك التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية، مثل nestin وSOX2. هذه الخلايا الجذعية العصبية يمكن أن تكون متباينة أيضا على الخلايا العصبية، دبق نجمي الخلايا و oligodendrocytes في وسائل الإعلام التمايز محدد. يمكن الوصول إليها بسهولة عن طريق عينات الدم المحيطية الإنسان، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لاستخلاص الخلايا الجذعية العصبية لمزيد من التمايز للخلايا العصبية في المختبر لنماذج من الاضطرابات العصبية ويمكن أن تقدم الدراسات المتعلقة المرضية وعلاج تلك الأمراض.
Introduction
في المختبر وقد استخدمت الثقافات العصبية كأداة أساسية للدراسات الأمراض العصبية. الحيوان الأساسي (ومعظمهم من القوارض) الثقافات العصبية 1 و 2 و خطوط الخلايا العصبية البشرية المستمدة من الاورام الدبقية أو الأورام الأخرى هي الأكثر استخداما في مثل هذه الدراسات. ومع ذلك، فقد تم الاعتراف بأن هناك اختلافات كبيرة بين القوارض والخلايا البشرية. لا يمكن أن تترجم العديد من النتائج على أساس القوارض للإنسان. وعلاوة على ذلك، مع التطورات السريعة في تحليل المعلومات الجينومية الجماعية والتحرير الجين السهل نسبيا وكله تسلسل الجينوم، فإن الاتجاه هو المزيد والمزيد من استعداداتها لاكتشاف المرض الجينات معرضة وترسيم وظائفهم وأدوارهم في أمراض معينة، مما يجعل الخلايا العصبية البشرية قليلة وقد خطوط الخلايا استخدام تقتصر فقط. من الناحية النظرية، والثقافات العصبية الأولية الإنسان المستمدة من عينات من الجهاز العصبي المريض هي أفضل خيار إلا أنه من المستحيل للحصول عليها. ميث بالتالي البديلالمواد المستنفدة للأوزون ضرورية. في السنوات الأخيرة، تم ملاحقة بعض المناهج، مع اثنين من كونها الأكثر تمييزها. بعد تطوير هذه التقنية لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (IPSC) باستخدام الماوس والخلايا الجسدية الإنسان 3، 4، والخلايا العصبية يمكن أن يكون أبعد متباينة منها 5-7. ومع ذلك، وتوليد وتوصيف IPSC يطالب كثيفة العمالة، والتقنيات، والمدخلات الوقت، وأحيانا حتى باهظة. بعد فترة وجيزة، تم تطوير نهج آخر لتحويل الخلايا العصبية مباشرة من الخلايا الجسدية 8، 9. وبما أن الخلايا العصبية الناتجة غير التكاثري، فإنه يحد تطبيقه في الدراسات المكثفة وفحص المخدرات، الأمر الذي يتطلب كمية كبيرة من الخلايا. للاستفادة من التقنيات على حد سواء، الاشتقاق المباشر للالجذعية العصبية / الخلايا الاصلية من الخلايا الجسدية تم استكشافها من قبل عدة مجموعات 10-12، التي تتجاوز عملية شاقة من الجيل IPSC وتوصيف ولكن لا يزال. نحن نتعاملقصر عدد محترم من الخلايا الجذعية العصبية للتمايز العصبي لاحق. لقد أظهرنا سابقا أنه بعد إدخال عوامل النسخ ياماناكا في الخلايا الاصلية المكونة للدم والخلايا الجذعية العصبية يمكن أن تتولد مباشرة باستخدام خلية العصبية السلف اختيار المتوسطة 13. هنا، ونحن التقرير الطريقة بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد بروتوكول مفصلة لتوليد مباشرة الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا الاصلية المكونة للدم الطرفية.
مقارنة مع الخلايا الليفية، الدم المحيطي البشري هو أكثر سهولة. باستخدام بروتوكول المقدمة، أكثر من 1 × 10 5 الخلايا المكونة لل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Materials
| Material List | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Separation Medium | Lonza | 17-829E | 1 X |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 mL |
| Human Serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2mM |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1X |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1X |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/mL |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/mL |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/mL |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/mL |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/mL |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1X |
| N2 supplement | Life technologies | 17502-048 | 1X |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life technologies | 17504-044 | 1X |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1X |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | 1X |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1X |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 ug/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
