Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Summary

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Abstract

Cultures de neurones spécifiques de maladies humaines sont essentielles pour générer des modèles in vitro pour les maladies neurologiques humaines. Cependant, le manque d'accès aux cultures de neurones adultes humaines primaires soulève des défis uniques. Les développements récents dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) fournit une approche alternative pour obtenir des cultures de neurones à partir de fibroblastes de la peau grâce à des patients iPSC spécifique, mais ce processus est beaucoup de travail, nécessite une expertise spéciale et de grandes quantités de ressources, et peuvent prendre plusieurs mois. Cela empêche la large application de cette technologie à l'étude des maladies neurologiques. Pour surmonter certaines de ces questions, nous avons développé une méthode pour produire des cellules souches neurales directement à partir de sang périphérique humain adulte, en contournant le processus de dérivation iPSC. Des cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies à partir du sang périphérique humain adulte ont été cultivées in vitro et transfectées avec des vecteurs du virus Sendai contenant des facteurs de transcription Sox2, octobre4.3, Klf4, et c-Myc. Les résultats de transfection dans des changements morphologiques dans les cellules qui sont ensuite sélectionnés à l'aide de milieu neuronale progénitrice humaine contenant le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Les cellules résultantes sont caractérisées par l'expression de marqueurs de cellules souches neurales, comme la nestine et SOX2. Ces cellules souches neurales peuvent être en outre différenciés pour les neurones, astrocytes et oligodendrocytes dans un milieu de différenciation spécifique. En utilisant des échantillons facilement accessibles du sang périphérique humain, cette méthode pourrait être utilisée pour dériver des cellules souches neurales pour une différenciation plus poussée de cellules neurales pour la modélisation in vitro de troubles neurologiques et peut progresser les études liées à la pathogenèse et le traitement de ces maladies.

Introduction

In vitro des cultures de neurones ont été utilisés comme un outil fondamental pour l'étude des maladies neurologiques. Animaux primaires (principalement les rongeurs) des cultures de neurones ^{1, 2} et des lignées de cellules neurales humaines dérivées de gliomes et autres tumeurs sont le plus couramment utilisé dans de telles études. Cependant, il a été reconnu qu'il existe des différences significatives entre les rongeurs et les cellules humaines. Beaucoup de conclusions fondées sur les rongeurs ne peuvent pas être convertis pour les humains. En outre, avec l'évolution rapide dans l'analyse de l'information de masse génomique et le montage de gène relativement facile et le séquençage du génome entier, la tendance est de plus en plus axé sur la découverte de gènes sujettes aux maladies et de délimiter leurs fonctions et leurs rôles dans les maladies spécifiques, ce qui rend les quelques neuronal humain lignées cellulaires ne ont limité l'utilisation. Théoriquement, les cultures de neurones primaires humaines dérivées à partir d'échantillons du système nerveux du patient sont le meilleur choix, mais ils sont impossibles à obtenir; meth donc alternatifSAO sont nécessaires. Au cours des dernières années, certaines approches ont été poursuivis, avec deux étant le plus distinguée. Après le développement de la technique de génération de cellules souches pluripotentes induites (CISP) en utilisant la souris et des cellules somatiques humaines ^{3, 4,} cellules neurales pourrait être encore différencié d'eux ^7.5. Cependant, la génération et la caractérisation iPSC demande de main-d'œuvre, les techniques, et l'entrée de temps, parfois même prohibitif. Peu de temps après, une autre approche a été développée pour transformer directement des cellules neuronales à partir de cellules somatiques ^{8, 9.} Comme les neurones qui en résultent sont non proliférative, il limite son application dans des études intensives et le criblage de médicaments, ce qui nécessite une grande quantité de cellules. Pour profiter des avantages des deux techniques, dérivation directe des souches neurales / cellules progénitrices de cellules somatiques a été explorée par plusieurs groupes ^{de 10 à 12,} qui contourne le processus fastidieux de la production et la caractérisation iPSC mais toujours dispodes un nombre décent de cellules souches neurales pour différenciation neurale tard. Nous avons précédemment montré que, suite à l'introduction de facteurs de transcription Yamanaka dans des cellules progénitrices hématopoïétiques, les cellules souches neurales peuvent être générés directement en utilisant une cellule neuronale progénitrice ¹³ Sélection du support. Ici, nous rapportons la méthode en détail.

Protocol

1. Enrichissement de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang total des adultes REMARQUE: Les cellules progénitrices hématopoïétiques ou les cellules CD34 + peuvent être purifiés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant de diverses sources, dont le sang de cordon, la matière de cytaphérèse et le sang total en utilisant des procédés à base de centrifugation à gradient de densité. Procédé énumérés ici utilise le sang total, par e…

Representative Results

La qualité des cellules CD34 est critique pour le succès de neurones transduction de cellules souches. Cellules CD34 haute qualité prolifèrent au cours du premier couple de jours de culture et apparaissent comme non adhérente, les cellules homogène rondes, flottant juste au-dessus du fond des récipients de culture (figure 1A). Les résultats de l'infection réussie en agrégats de cellules, qui se étend au fil du temps (figure 1B), tandis que les agrégats de cellules …

Discussion

Un protocole détaillé pour générer directement des cellules souches neurales à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques périphériques est fourni.

Par rapport à des cellules de fibroblastes, du sang périphérique humain est plus accessible. En utilisant le protocole présenté, plus de 1 x 10 ⁵ cellules progénitrices hématopoïétiques, ou des cellules positives CD34, peuvent être enrichies à partir de 10 ml de sang entier. Bien que la contamination par de…

Materials

Material List
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lymphocyte Separation Medium	Lonza	17-829E	1 X
SepMate	Stemcell Technologies	15415	15 mL
Human Serum	Invitrogen	34005-100
Antibiotics	Gibco	15240-062	1%
CD34 MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-056-701
EDTA	Cellgro	46-034-Cl	2mM
MACS LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
StemSpan SFEM Medium	Stemcell Technologies	9650	1X
IMDM	Quality Biologicals	112-035-101	1X
TPO	Peprotech	300-18	100 ng/mL
Flt-3	Peprotech	300-19	100 ng/mL
SCF	Peprotech	300-07	100 ng/mL
IL-6	Peprotech	200-06	20 ng/mL
IL-7	Peprotech	200-07	20 ng/mL
IPS Sendai Reprogramming Kit	Life technologies	A1378001
Cell scraper	Sarstedt	83.183
DMSO	Sigma	D2650
CryoTube vials	Thermo	368632
Mr. Frosty container	Thermo	5100-0001
DMEM/F12	Life technologies	12400-024	1X
N2 supplement	Life technologies	17502-048	1X
Bovine serum albumin	Sigma	A2934	0.1% (w/v)
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 supplement	Life technologies	17504-044	1X
NSC serum free medium	Life Technologies	A1050901	1X
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips	BD Bioscences	354087
cAMP	Sigma	A9501	300 ng/ml
Vitamin C	Sigma	A0278	0.2 mM
BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml
GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/ml
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957	1X
PDGF-AA	Peprotech	100-13A	10 ng/ml
NT-3	Peprotech	450-03	2 ng/ml
Shh	Peprotech	1314-SH/CF	2 ng/ml
T3	Sigma	T6397	3 nM
PFA	Sigma	P6148	4%
PBS	Quality Biological	119-069-101	1X
Goat serum	Sigma	G9023	4%
TritonX-100	Sigma	T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin	Millipore	AB5922	1:1000 dilution
Anti-SOX2  antibody	Applied Stemcell	ASA0120	Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody	Promega	G712A	1:1000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody	Sigma	G4546	1:100 dilution
Anti-O4 antibody	R&D Systems	MAB1326	IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody	Life techniologies	A11012	1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody	Life techniologies	A11001	1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody	Life techniologies	A21042	1:250 dilution
DAPI	Sigma	D9542	1 ug/ml