MACROMOLECULAR 3D पुनर्निर्माण के लिए एक नमूना तैयार करने पर प्राइमर और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा संग्रह: क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की है और don'ts

Summary

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Abstract

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.

The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.

The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Introduction

cryoEM के लक्ष्य को उनके पैतृक हाइड्रेटेड राज्य में अणुओं की इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवियों को प्राप्त करने के लिए है। Vitrified पानी में macromolecule embedding के आधार पर, एक जमे हुए हाइड्रेटेड नमूना सीधे पेश किया जा सकता है और मंदिर साधन में कल्पना की। कांच में रूपांतर, ठंड फ्लैश (10,000 ^ओ सी / एसईसी) द्वारा हासिल की, पानी क्रिस्टलीकरण बिना नमूना जमा देता है और ठंड के दौरान आणविक rearrangements नगण्य हैं कि सुनिश्चित करता है। आसपास के बफर के संबंध में नमूने के इलेक्ट्रॉन बिखरने के अतिरिक्त किसी भी दाग ^एक के अभाव में macromolecule को देखने के लिए एक छोटी लेकिन पर्याप्त विपरीत प्रदान करता है। कम्प्यूटरीकृत इमेज प्रोसेसिंग फिर macromolecule '3 डी संरचना विश्राम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ~ 500 kDa- बहु एमडीए रेंज में बड़े बड़े अणुओं (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डाटा बैंक (EMDB) प्रविष्टियों में से 80% से अधिक का प्रतिनिधित्व) cryoEM के लिए आदर्श नमूने हैं; ये प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड शामिल गomplexes, और झिल्ली प्रोटीन एक bilayer में एम्बेडेड। इन अणुओं (पी डी बी डेटाबेस में कम से कम 2% प्रविष्टियों के साथ) सघन किए जाने की संभावना कम होती है अभी तक यह एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर द्वारा हल छोटे टुकड़ों cryoEM द्वारा बनाई गई 3 डी लिफाफे में डॉक किया जा सकता है कि अक्सर मामला है। दूसरी ओर, cryoEM द्वारा हल के सबसे बड़े संरचनाओं में से कुछ पतली धारा मंदिर ² से भरा कोशिका के भीतर से पहचाने जाने योग्य हैं। इस प्रकार, cryoEM प्रभावी ढंग से subcellular और परमाणु संरचना के बीच आकार और संकल्प की खाई को पुल।

CryoEM दाग बहिष्कार का क्षेत्र एक जोरदार विषम "नकारात्मक" छवि ³ बनाता है जिससे macromolecule निर्जलित और भारी धातु दाग की एक परत से घिरा हुआ है, जहां नकारात्मक धुंधला की अधिक शास्त्रीय विधि (एन एस), की तुलना में बेहतर macromolecule देशी संरचना को दर्शाता है। दोनों ही मामलों में इलेक्ट्रॉन बीम अणुओं की 2D प्रक्षेपण छवियों कहा जाता है, कण, जहां का उत्पादनहेप इलेक्ट्रॉन बीम के लिए सम्मान के साथ macromolecule के उन्मुखीकरण पर निर्भर करता है। कई कणों, कम से कम ~ 1000 और कोई ऊपरी सीमा के साथ, शोर अनुपात (SNR) औसत हालांकि करने के लिए संकेत को बढ़ाने के लिए, और कण के स्थानिक उन्मुखीकरण मापदंडों को खोजने के लिए 'एकल कण विश्लेषण' (एसपीए) सॉफ्टवेयर के साथ कंप्यूटर पर विश्लेषण किया जा सकता वापस प्रक्षेपण ^4-7 से macromolecule '3 डी संरचना विश्राम करने की जरूरत है। उच्च SNR के साथ एन एस, प्रारंभिक नमूना लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है और एक नए सिरे से 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए; अपने संकल्प को शायद ही कभी भारी धातु अनाज के निर्जलीकरण और आकार द्वारा लगाया गया है जो 20 ए, से अधिक है। सामान्य में, cryoEM 3 डी संरचनात्मक निर्धारण के लिए, एक कम संकल्प 3D पुनर्निर्माण, पहले एन एस से प्राप्त किया जाता है और फिर cryoEM आगे इसकी आंतरिक संरचना को देखने के लिए, अपने मूल हाइड्रेटेड राज्य में macromolecule अध्ययन करने के लिए यह कम संकल्प प्रारंभिक नक्शा परिष्कृत करने के लिए प्रयोग किया जाता है और अपने संकल्प को बढ़ाने के लिए। नाते कि एन एस मॉडल विकृत किया गया था (सबसे आम उदाहरण निर्जलीकरण ⁸ से उत्पन्न सपाट है) और cryoEM कणों कम SNR, तो विरूपण कम SNR में आम है जो cryoEM मॉडल (मॉडल-पूर्वाग्रह विरूपण साक्ष्य, में ले सकता था अगर डेटासेट ^9)। स्ट्रक्चरल विरूपण एनएस और cryoEM कच्चे कणों के बीच और कच्चे cryoEM कणों और सपाट दिशा के orthogonal 3 डी मॉडल की इसी अनुमानों के बीच बेमेल नतीजा होगा। 3 डी मॉडल लगातार शोधन चक्र से होकर गुजरती है के रूप में मॉडल पूर्वाग्रह से ही हल हो सकती है। कि 3 डी मॉडल से कच्चे cryoEM कणों और इसी के अनुमानों के बीच पत्राचार की कमी के रूप में पहचान की जाएगी, जो घटित नहीं होना चाहिए, तो एक नए सिरे से मॉडल cryoEM डेटा से निर्माण किया जाना चाहिए। एक अच्छा दृष्टिकोण सर्वोत्तम संभव cryoEM मॉडल का चयन करने के लिए कई संभव 3 डी संस्करणों उपज हो सकती है जो कोणीय पुनर्गठन एल्गोरिथ्म ^10, उपयोग, और फिर एन एस 3 डी मॉडल का उपयोग करने के लिए हो सकता हैकि ¹¹ आगे परिष्कृत किया जाएगा। एक और भी बेहतर रणनीति (चर्चा में समर्पित अनुभाग देखें) cryoEM डाटासेट की SNR बढ़ाने के लिए है।

शुद्ध macromolecule के जैव रासायनिक गुणवत्ता अंतिम परिणाम में एक अत्यंत प्रभाव है। macromolecule, heterologous प्रणालियों में ऊतक से शुद्ध या व्यक्त की, पवित्रता की एक उच्च डिग्री है और structurally बरकरार होने की जरूरत है। यह न तो समुच्चय फार्म चाहिए और न ही यह disaggregate चाहिए। एक विशेष रचना को परिभाषित करने के लिए, तैयारी शर्तों में एक समान गठनात्मक राज्य को बढ़ावा देना चाहिए। परिसरों का अध्ययन करने के लिए, इसे अन्यथा fixatives सफलतापूर्वक कम आत्मीयता बातचीत ^12,13 स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, उनके कश्मीर _डी एनएम रेंज में है कि हो सकता है।

Unprocessed cryoEM छवियों आयामों पर बहुमूल्य जानकारी, सामान्य रूपरेखा, एकत्रीकरण / multimerization, एकरूपता के राज्य, और macromolecu की आंतरिक संरचना उपजLe। फिर भी तकनीक की क्षमता बेहद छवि प्रसंस्करण के साथ बढ़ाया है। एक 3 डी संरचना macromolecule के समग्र वास्तुकला, ligands और सब यूनिटों, गठनात्मक परिवर्तन के 3 डी स्थान का पता चलता है, और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर द्वारा निर्धारित परमाणु संरचना की डॉकिंग में सक्षम बनाता है। संकल्प में वृद्धि हुई है के रूप में एक 3 डी पुनर्निर्माण की राशि की जानकारी stepwise बढ़ जाती है: जनरल 15-20 एक संकल्प में 9-10 एक अल्फा helices पर, परमाणु संरचना की स्पष्ट डॉकिंग परमिट 5 में यह विचार करने के लिए संभव है, छड़ के रूप में दिखाई दे रहे हैं बीटा चादरें, और 3.5 ए और बेहतर के प्रस्तावों पर यह एक परमाणु मॉडल ¹⁴ का निर्माण संभव है।

संभावना कम से कम 0.05 मिलीग्राम की 3-5 μl के रूप में / एमएल एक मंदिर ग्रिड तैयार करने के लिए पर्याप्त हैं, जानकारीपूर्ण छवियों और cryoEM एक आकर्षक तकनीक बनाने के नमूने की अपेक्षाकृत कम मात्रा से स्पा का उपयोग कर एक 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए। न्यूनतम वाद्य आवश्यकताओंcryoEM के लिए एक घर का बना या वाणिज्यिक क्रायो-सवार, अति उच्च निर्वात, छवि रिकॉर्डिंग मीडिया और कम खुराक किट, इसकी पम्पिंग स्टेशन, एक चमक निर्वहन तंत्र के साथ एक क्रायो धारक, और एक बाष्पीकरण के साथ एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप हैं। मंदिर पर गैर जरूरी है, लेकिन आगे वांछनीय विशेषताएं (सभी आधुनिक tems में वर्तमान) सीसीडी कैमरा या एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर, क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक (FEG), ऊर्जा छानने, और उच्च throughput डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर रहे हैं। सिद्धांत रूप में यह सॉफ्टवेयर हालांकि बढ़ डेटा भंडारण की जरूरत है और बाद में देखरेख पोस्ट प्रसंस्करण समय की आवश्यकता को ध्यान में रखा जाना करने के लिए, एक एकल cryoEM सत्र ¹⁵ में दसियों कणों के हजारों के इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है। इसके विपरीत हस्तांतरण समारोह (CTF) सुधार के साथ संयुक्त FEG helices अल्फा कल्पना करने के लिए पर्याप्त संकल्प पर पहुंच गया है कि सबसे अधिक 3 डी पुनर्निर्माण underlies। उस समय, संकल्प का स्तर भी नमूना पर निर्भर है: 10 एक संकल्प तक पहुँचने झिल्ली प्रोटीन के लिए कम आम है, जबकि अगरसमरूपता के उच्च क्रम परमाणु संकल्प अधिक प्राप्त है तो मौजूद है। प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों की हाल ही में विकास cryoEM इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शे की गुणवत्ता इन एक्स-रे विवर्तन डेटा ^16,17 से व्युत्पन्न से मेल खाता है, जहां (4x) कम या कोई समरूपता, के साथ भी बड़े अणुओं के लिए संकल्प परमाणु सक्षम है।

तकनीक की क्षमताओं illustrating व्यावहारिक उदाहरण cryoEM उनकी संरचनात्मक दृढ़ संकल्प में एक सतत प्रमुख भूमिका है, जहां बड़े अणुओं के चार महत्वपूर्ण प्रकार के लिए यहाँ प्रदान की जाती हैं। 60 गुना और वफादार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संरेखण कि परमिट उनके बड़े आकार के द्वारा डाटासेट बढ़ जाती है कि उनके icosahedral समरूपता के साथ (मैं), कई icosahedral वायरस की संरचना एसपीए ¹⁸ द्वारा पीछा cryoEM द्वारा पास परमाणु संकल्प को हल किया गया है। हम icosahedral वायरस, एडिनो से जुड़े वायरस (AAVs) के एक वर्ग का एक उदाहरण है, जो शो के लिए cryoEM द्वारा और cryoEM / एक्स-रे हरियाणा द्वारा पास परमाणु संरचनाBrid विधियों ^19,20 मौजूद हैं। (Ii) के पेचदार संरचना के साथ अणुओं सूक्ष्मनलिकाएं, तंतु और वायरस शामिल हैं। पेचदार धुरी के साथ उनके दोहराव इकाइयों पेचदार ज्यामिति ²¹ के लिए अनुकूलित स्पा की एक अधिक जटिल संस्करण से विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण में हम तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV), cryoEM ²² से परमाणु संकल्प को हल किया गया है कि एक शाही सेना वायरस दिखा। (Iii) के बड़े घुलनशील प्रोटीन कथन से अध्ययन किया गया है। इन के अलावा, सममित multimeric सिलेंडरों के गठन अणुओं अक्सर subnanometer संकल्प ^23,24 पर हल एक आवर्ती वास्तुकला का गठन। यहाँ हम एक संकर आणविक मॉडल cryoEM / एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी संकर विधियों ²⁵ से बनाया गया था, जहां KLH, एक अकशेरुकी ऑक्सीजन वाहक, की छवियों को दिखाने के लिए। (चतुर्थ) झिल्ली प्रोटीन प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण वर्ग के हैं; वे मानव जीनोम द्वारा कोडित प्रोटीन के बारे में 1/3 का गठन, फिर भी वे कारण tr के साथ जुड़े जटिलताओं के संरचनात्मक रूप चिह्नित करने के लिए मुश्किल हो जाता हैसंयुक्त किसी भी संरचनात्मक तकनीक के द्वारा हल संरचनाओं के कम से कम 1.5% का गठन ansmembrane डोमेन स्थिरीकरण ^26। उनकी संरचनात्मक निर्धारण में cryoEM और 3 डी पुनर्निर्माण की भूमिका ryanodine रिसेप्टर (RyR), मांसपेशियों में संकुचन और मस्तिष्क संकेतन में महत्वपूर्ण एक बड़ी यूकेरियोटिक इंट्रासेल्युलर सीए ^{2 +} चैनल के साथ उदाहरण है। तिथि करने के लिए उच्चतम संकल्प cryoEM संरचनाओं, 10 एक संकल्प के साथ, माध्यमिक संरचना ²⁷ प्रकट करते हैं।

Protocol

1. क्रायो-धारक तैयार करना और रखरखाव नोट: सूखी पम्पिंग स्टेशन, एक टर्बो पम्पिंग स्टेशन और एक या अधिक ठंड चरण नियंत्रकों से मिलकर, मुख्य रूप से तीन प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है: एक) यह है कि वे इस्तेमाल किया जा रहा नहीं कर रहे हैं जब क्रायो धारकों स्टोर करने के लिए एक सुरक्षित जगह है। धारकों को स्टोर करने के लिए उचित तरीका वैक्यूम के अंतर्गत स्टेशन में उन्हें छोड़ रहा है। ख) तरल नाइट्रोजन देवर और संपर्क में है क्रायो धारक की नोक से निकाल दिया जाता है तब होती है जब ठंढ और नमी buildup के लिए लुप्त हो जाना; इस वार्म अप चक्र के साथ हासिल की है। ग) जिओलाइट अवशोषक पुनर्जीवित करने के लिए, और cryoholder Dewars में एक उच्च वैक्यूम प्राप्त करने के लिए। इस क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कर जब एक निरंतर तापमान आयोजित करने के लिए आवश्यक है। वार्म अप चक्र। पम्पिंग स्टेशन के पंप बंदरगाहों में से एक में क्रायो धारक डालें। धारक का वैक्यूम वाल्व के नीचे धातु आउटलेट के लिए निकासी ट्यूब में से एक को यह मिला। मेकस्टेशन (v1, V2, v3) पर और क्रायो धारक पर सभी वाल्व बंद हो जाती हैं कि सुनिश्चित करें। ठंड चरण नियंत्रक पर मुड़ें और नियंत्रण की हड्डी के माध्यम से धारक से कनेक्ट। टर्बो पम्पिंग स्टेशन की बिजली स्विच चालू करें। ठंड चरण नियंत्रक में वार्म अप चक्र विकल्प शुरू करो। टर्बो पम्पिंग स्टेशन में वैक्यूम 10 -3 Torr या बेहतर पढ़ता है, तितली वाल्व V2 के खोलने निर्वात स्थिर जब तक प्रतीक्षा करें, और फिर तितली वाल्व V1 के खुला। धारक में तापमान 20 डिग्री सेल्सियस से ऊपर स्थिर है जब तक लगभग 30 मिनट के लिए गर्म चक्र चलाते हैं। बंद V1 है, और फिर चक्र बंद करो। जिओलाइट चक्र। 4 घंटा और ओ के बीच जिओलाइट साइकिल चलाने / एन एक CryoEM सत्र से पहले, और एक सप्ताह में एक बार अगर उपयोग में नहीं है। जिओलाइट चक्र विकल्प आरंभ और 1-2 एक्स 10 -4 Torr की रेंज में, एक अच्छा वैक्यूम प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय का चयन करें, और इस तरह लंबे समय पकड़। जब वैक्यूम 10 तक पहुँच -3Torr, V3 के देवर निकासी वाल्व खुला। पम्पिंग स्टेशन तो धारक को लाइन खाली होगा; निर्वात स्थिर जब तक प्रतीक्षा करें। क्रायो धारक पर वाल्व खुला। चक्र पूरा हो गया है, वे खोला गया जिसमें विपरीत क्रम में वाल्व को बंद: वाल्व धारक, तो V3 है, V2 के लिए, और अंत v1 पर। टर्बो पम्पिंग स्टेशन और ठंडे चरण नियंत्रक को बंद करें, और ठंड चरण नियंत्रक और टर्बो पम्पिंग स्टेशन से क्रायो धारक काट। 2. ग्रिड तैयारी सफाई। नोट: वाणिज्यिक छेददार ग्रिड का उपयोग कर, यह निर्माण की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया गया था कि किसी भी अवशिष्ट बहुलक को दूर करने के क्रम में, उपयोग करने से पहले उन्हें साफ करने के लिए सिफारिश की है। तल पर रखी फिल्टर पेपर के पाँच परतों के साथ एक गिलास पेट्री डिश में यह मत करो। छेददार कार्बन पक्ष का सामना करना पड़ के साथ फिल्टर पेपर पर ग्रिड रखें। एक गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग, ओ कई बूंदों के साथ कागज गीलाग्रिड के आसपास च क्लोरोफॉर्म वे सिर्फ अस्थायी शुरू तक। एक धूआं हुड हे / एन में थोड़ा खुला ढक्कन के साथ पेट्री डिश को कवर किया। नोट: बर्फ परत सीधे छेददार कार्बन ग्रिड में छोटे छेद के पार का गठन किया जा सकता है के रूप में पतली कार्बन समर्थन (2.2-2.3 कदम) छोड़ा जा सकता है। चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करना, दो नए सतहों को बेनकाब करने के लिए मीका का एक टुकड़ा फोड़ना। एक पेट्री डिश में कागज का एक टुकड़ा सफेद पर मीका चेहरा-अप के नए सतहों उजागर रखें। एक कार्बन बाष्पीकरण की घंटी जार में पेट्री डिश रखें। वैक्यूम नीचे 2 एक्स 10 -6 Torr है जब तक पंप नीचे अनुक्रम शुरू करो। कार्बन रॉड की सतह पर किसी भी दोष लुप्त हो जाना, कवर पेट्री डिश के साथ एक पूर्व वाष्पीकरण प्रदर्शन करते हैं। फिर बेल जार हवा और पेट्री डिश से कवर निकालें। वैक्यूम कार्बन की एक पतली परत (~ 5 एनएम) के साथ मीका 10 -6 Torr और कोट के नीचे है, जब तक पंप नीचे अनुक्रम प्रदर्शन करते हैं। कार्बन के दौरान नेत्र सुरक्षा का प्रयोग करेंवाष्पीकरण। मीका चादर के नीचे रखा गया था कि कागज पर जिसके परिणामस्वरूप अंधेरे से कार्बन फिल्म की मोटाई मॉनिटर। मंदिर ग्रिड को पतला कार्बन स्थानांतरण। लेपित अभ्रक के एक 0.5 एक्स 1 सेमी टुकड़ा काट और फ़िल्टर, de-ionized पानी की सपाट सतह पर कार्बन बंद तैरने लगते हैं। एक फ्लैट पानी की सतह प्राप्त करने के लिए ऑप्टिकल लेंस कागज का प्रयोग करें। चिमटी का उपयोग करना, अस्थायी कार्बन की परत के ऊपरी सतह के साथ संपर्क में ग्रिड की छेददार कार्बन पक्ष रखा और इसे उठा। ग्रिडों के लिए पर्याप्त संख्या तैयार कर रहे हैं जब तक दोहराएँ 2.3.1 और 2.3.2 कदम। निर्वहन ग्लो। नोट: चमक निर्वहन हाइड्रोफिलिक में ग्रिड के स्वाभाविक रूप से हाइड्रोफोबिक कार्बन-कोटिंग परत धर्मान्तरित। यह कदम वैकल्पिक है। कार्बन पक्ष Parafilm के साथ कवर एक 7.5 एक्स 2.5 सेमी गिलास स्लाइड पर सामना करना पड़ रहा साथ ग्रिड रखें। चमक-निर्वहन उपकरणों के चेंबर में यह प्लेस और चैम्बर बंद करें। पंप25 मा 20 सेकंड और 7 एक्स 10 -2 mbars के लिए बेल जार और चमक-मुक्ति। नोट: एक हल्के बैंगनी चमक दिखाई हो जाता है इस समय के दौरान। अन्यथा, वे चमक फिर से छुट्टी दे दी होने की आवश्यकता होगी, ग्रिड के साथ गिलास स्लाइड निकालें और एक घंटा के भीतर उन्हें इस्तेमाल करते हैं। 3. नमूना डुबकी ठंड नोट: तरल नाइट्रोजन और एटैन बौछार के खिलाफ की रक्षा के लिए इस उपकरण का उपयोग करते समय सुरक्षा चश्मा और उपयुक्त जूते का प्रयोग करें। डुबकी ठंड तंत्र को चालू करें। आसुत जल के साथ humidifier जलाशय भरें। वांछित तापमान, सापेक्षिक आर्द्रता और धब्बा समय के लिए जल्दी से आगे बढ़नेवाला की स्थिति, दाग बल और सोखना समय (22 डिग्री सेल्सियस, 95%, 2 सेकंड, यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में दो और 40 सेकंड) निर्धारित करें। नई सोख्ता फिल्टर पेपर रखें। स्थिरता (लगभग 10 मिनट) हासिल की है, जब तक तरल नाइट्रोजन के साथ बाहरी जलाशय भरने से एटैन कंटेनर शांत हो जाओ। तरल नाइट्रोजन boilin बंद हो जाता है एक बारजी, भीतरी कक्ष में एटैन टैंक से आ रही ट्यूब की नोक जगह है और बहुत धीरे धीरे वाल्व खुला। भीतरी कक्ष में एटैन दव्र और ऊपर से 1 मिमी करने के लिए इसे भरने के लिए। एटैन ठंड से बचें। चेतावनी: एटैन अत्यंत ज्वलनशील और विस्फोटक है। यकीन चिमटी डुबकी ठंड तंत्र के भीतर गठबंधन कर रहे हैं बनाओ। आर्द्रता चालू करें। चिमटी पर एक ग्रिड लोड, और छेददार ग्रिड के कार्बन सतह (सुस्त ओर) पर नमूना के 3-5 μl लोड। नमूना ग्रिड को सोखना और एक पतली तरल परत प्राप्त करने के लिए सोख्ता प्रदर्शन करने के लिए प्रतीक्षा करें। तरल एटैन में डूबनेवाला द्वारा ग्रिड फ्लैश फ्रीज। तेजी से चिमटी पकड़े तरल एटैन से चिमटी ग्रिड विधानसभा निकालें, और तरल नाइट्रोजन के साथ बाहरी कक्ष को हस्तांतरण। तरल नाइट्रोजन में डूबे एक छोटे से ग्रिड बॉक्स करने के लिए ग्रिड स्थानांतरण। या तो भंडारण टैंक के लिए स्थानांतरण के दौरान तरल नाइट्रोजन में हर समय vitrified नमूना रखने के लिए सुनिश्चित करेंया क्रायो धारक के लिए। नोट: ग्रिड बक्से में कम से कम एक वर्ष के लिए एक बड़ी क्षमता (35-50 एल) तरल नाइट्रोजन देवर में संग्रहित किया जा सकता है। सुविधाजनक भंडारण के लिए वे दो drilled शीर्ष पर छेद और देवर के मुंह से निकाला जा सकता है कि अपनी टोपी से जुड़ी एक मछली पकड़ने की रेखा के साथ एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में रखा जा सकता है। 4. मंदिर को क्रायो ग्रिड स्थानांतरण क्रायो स्थानांतरण वर्कस्टेशन में क्रायो धारक डालें। प्रविष्टि के दौरान धारक की नोक नुकसान नहीं ख्याल रखना। किसी भी ऑप्टिकल लेंस कागज के साथ इसे हटाने अगर वहाँ है, रॉड और एक लूप का उपयोग कर क्रायो धारक के हे अंगूठी पर छोटे फाइबर की उपस्थिति और धूल के लिए जाँच करें। क्रायो धारक के देवर और तरल नाइट्रोजन के साथ कार्य केंद्र पोत भरें। कार्य केंद्र के साथ आता है कि फंस कीप का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन spilling से बचें। तापमान की निगरानी, ​​और तरल नाइट्रोजन & # जोड़कर रखने के लिए ठंड चरण नियंत्रक करने के लिए क्रायो धारक कनेक्ट160; तापमान लगभग -194 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है जब तक। तरल नाइट्रोजन का स्तर वर्कस्टेशन पोत और क्रायो धारक देवर दोनों में वैक्यूम मुहर के स्तर के नीचे है कि सुनिश्चित करें। ग्रिड चिमटी, क्लिप अंगूठी और वर्कस्टेशन पर क्लिप अंगूठी उपकरण की कुंद अंत प्री-शांत करते हैं। इसके अलावा बड़े चिमटी का एक सेट और तरल नाइट्रोजन के साथ भरा एक और देवर में एक शराबी पूर्व शांत करते हैं। जल्दी बड़े चिमटी का उपयोग कर कार्य केंद्र में तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हाइड्रेटेड ग्रिड युक्त क्रायो ग्रिड बॉक्स हस्तांतरण। , शराबी के साथ क्रायो ग्रिड बॉक्स खोलने जमी हाइड्रेटेड ग्रिड लेने के लिए और नमूना धारक स्लॉट में यह जगह। ग्रिड के शीर्ष पर क्लिप अंगूठी प्लेस और यह जगह में मजबूती से बैठा है जब तक क्लिप अंगूठी उपकरण की कुंद अंत के साथ इसे प्रेस धीरे। क्रायो शटर बंद करें। कार्य केंद्र से उपकरण और क्रायो ग्रिड बॉक्स निकालें। मिनी के क्रम में माइक्रोस्कोप कंसोल के लिए धारक और ग्रिड के साथ पूरे कार्य केंद्र ले जाएंकमरे में हवा में ग्रिड के हस्तांतरण के समय Mize। पहले से भरा है और कम से कम 20 मिनट के लिए ठंडा हो गया था जो तरल नाइट्रोजन के साथ मंदिर विरोधी contaminator बंद शीर्ष। -60 ° करने के लिए खुर्दबीन मंच पूर्व झुकाव। नोट: धारक airlock में डाला जाता है के रूप में यह तरल नाइट्रोजन के नुकसान को कम कर देंगे। माइक्रोस्कोप पर पूर्व पंप airlock चक्र शुरू। (यह एक FEG मंदिर है, खासकर अगर) इलेक्ट्रॉन बंदूक के लिए वाल्व बंद कर दिया है कि सुनिश्चित करें। पूर्व पंप airlock अनुक्रम क्रायो धारक डालने से पहले (लगभग 2 मिनट) समाप्त करने के लिए प्रतीक्षा करें। नोट: इस चरण में बुझा किया जा रहा है पर लाल बत्ती ने संकेत दिया है। Airlock में धारक डालें और यह 90 डिग्री दक्षिणावर्त बारी बारी से; तापमान की निगरानी के लिए क्रायो धारक को ठंड चरण नियंत्रक कॉर्ड कनेक्ट। लाल बत्ती बुझा है जब तक फिर से रुको और मंदिर की हाय में धारक सम्मिलित करने के लिए मंच और वापस 0 डिग्री की स्थिति में धारक दोनों बारी बारी सेजीएच निर्वात स्तंभ। तापमान कभी नहीं स्फटिक बर्फ के गठन से बचने के लिए -160 डिग्री सेल्सियस से ऊपर चला जाता है कि सुनिश्चित करें। क्रायो धारक के देवर फिर से भरना। धारक को thermally equilibrated गया है और मंदिर निर्वात छवियों रिकॉर्डिंग से पहले बरामद किया है जब तक 45 मिनट – 15 रुको। तरल नाइट्रोजन के उत्साह से भरा हुआ पाया जाता है, तरल नाइट्रोजन भरने ऊंचाई परिवर्तन, या धीरे एक कपास झाड़ू के साथ बुदबुदाती मूल छूना। 5. कम खुराक डाटा संग्रह नोट: कम खुराक डेटा संग्रह तकनीक / A 2 20 इलेक्ट्रॉनों के लिए जोखिम को सीमित करके नमूना इलेक्ट्रॉन विकिरण क्षति को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह तीन विन्यास के बीच बारी द्वारा हासिल की है: उच्च वृद्धि (~ 150,000X) और देखने के छोटे से क्षेत्र, और "जोखिम" के साथ, कम बढ़ाई (~ 5,000X) और देखने के लिए, "ध्यान" के व्यापक क्षेत्र के साथ, "खोज", वांछित अंतिम magni साथfication और हित के क्षेत्र युक्त दर्ज किया जाना है। मोड के बीच में किरण खाली। मंदिर और कम खुराक कार्यक्रम निर्धारित क्रायो शटर वापस लेना और स्तंभ वाल्व खुला। मंच के केंद्र और 15 ° ± चरण रॉक करने के लिए अल्फा wobbler का उपयोग कर eucentric ऊंचाई (जेड) की स्थापना की। मंच का घोड़ा है, जबकि कोई सराहनीय आंदोलन जब तक वहाँ Z स्थिति को समायोजित करें। कम खुराक कार्यक्रम को सक्रिय और प्रत्येक विधा के लिए डिटेक्टर का चयन करें। जोखिम मोड में, कोई कार्बन है कि ग्रिड के एक क्षेत्र को खोजने के दर्ज होने की क्षेत्र पूरी तरह से प्रबुद्ध इतना है कि इष्टतम कंडेनसर एपर्चर और स्थान आकार का चयन करके रोशनी समायोजित करें। Overcondensation दिशा में बीम प्रसार करने के लिए सुनिश्चित करें। खोज मोड में, उच्च आवर्धन पर आसानी से पहचाना होगा कि एक छोटी सी सुविधा पाते हैं। जोखिम मोड में, जॉयस्टिक (XY चरण नियंत्रक) के साथ इस सुविधा केंद्र। करतब अगर कम बढ़ाई प्रारंभure देखने के क्षेत्र में नहीं है। खोज मोड में, कम खुराक XY छवि पारी नियंत्रण का उपयोग कर क्षेत्र के केंद्र के लिए इस सुविधा को ले आओ। जोखिम मोड के पास जाकर यह दर्ज किया जा क्षेत्र से बाहर है जब तक जॉयस्टिक का उपयोग कर अक्ष के झुकाव के साथ सुविधा के लिए कदम (0.5-3 माइक्रोन)। मोड ध्यान केंद्रित करने के लिए जाओ और xy छवि पारी नियंत्रण का उपयोग कर सुविधा केंद्र। सुविधा को देखने के क्षेत्र में नहीं है तो कम बढ़ाई प्रारंभ करें। सभी समय पर केन्द्रित किरण रखें। डाटा संग्रह क्रायो शटर वापस लेना और स्तंभ वाल्व खुला। कम खुराक कार्यक्रम को सक्रिय करें। खोज मोड में, पतली, सजातीय बर्फ युक्त एक ग्रिड वर्ग की पहचान। एक उपयुक्त छेद का चयन करें और क्षेत्र के केंद्र में जगह है। मोड ध्यान केंद्रित करने और छवि ध्यान केंद्रित करने के लिए स्विच करें। 4.5 माइक्रोन – तो फिर 0.5 के बीच छवि underfocus। जोखिम मोड में स्विच करें और छवि रिकॉर्ड है। 5.2.3-5.2.4 मोड खोज और कदम दोहराने के लिए स्विच करें।परहेज ग्रिड वर्ग के पार ले जाने से पूर्व उजागर अच्छा छेद दर्ज किया जाना है। ग्रिड वर्ग समाप्त करें और एक और अच्छा करने के लिए एक चाल है। ऊंचाई (जेड) बदल डालना और डेटा संग्रह जारी है।

Representative Results

चित्रा 1 में उल्लिखित सभी प्रोटोकॉल चरणों की सावधानी से निष्पादन जमे हुए हाइड्रेटेड, गैर दाग अणुओं के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है। विभिन्न संरचनात्मक विशेषताओं के साथ चार प्रतिनिधि नमूनों के लिए परिणाम दिखाए जाते हैं। एनएस और cryoEM के तरीकों से प्राप्त उनकी सूक्ष्म छवियों (चित्रा 2) तुलना कर रहे हैं। AAV5 (i) एन एस चित्र के चारों ओर 130 एक व्यास के वायरस कणों की तरह प्रकट करते हैं। पूर्ण और खाली संरचनाओं के साथ साथ मौजूदगी क्रमशः, और संरचनात्मक रूप बरकरार capsids (दाग प्रवेश की अनुमति है) टूट से मेल खाती है। CryoEM समान रूप से खाली संरचनाओं से पता चलता है; वास्तव में इन वायरल कणों आनुवंशिक सामग्री 28 शामिल नहीं है। CryoEM उनके icosahedral फार्म को दर्शाती है, ज्यादातर हेक्सागोनल कणों से पता चलता है, जबकि एन एस प्रबल दौर कणों से पता चलता है। (Ii) के दोनों 23 एक दृश्य की एक पेचदार दोहराने के साथ अक्सर लंबे समय तक 0.1 माइक्रोन से अधिक 180 एक व्यास और चर लंबाई की पेचदार TMV शो छड़ की छवियों,एन एस में और cryoEM में। 40 एक केंद्रीय चैनल cryoEM छवियों में एन एस छवियों में दाग और खाली से भरा है। (Iii) के मूल निवासी KLH, 8 एमडीए की एक didecamer, 350 एक व्यास और 400 लंबाई की विशेषता बैरल में assembles। एनएस और cryoEM KLH के आयताकार पक्ष विचारों और परिपत्र विचारों अंत पर प्रकट करते हैं। दोनों तकनीकों छह समरूपता अक्ष को सीधा स्त्रिअतिओन्स और प्रत्येक स्तर के भीतर समान रूप से स्थान दिया गया रूपात्मक इकाइयों प्रकट करते हैं। CryoEM एक खाली आंतरिक संरचना का पता चलता है। (चतुर्थ) Ryanodine रिसेप्टर, 2.26 एमडीए की एक बड़ी tetrameric इंट्रासेल्युलर चैनल, 275 एक्स 275 एक 2 के एक वर्ग के रूप में देखा जाता है। इस तरह के एक केंद्रीय क्रॉस और एन एस ने दाग संचय के रूप में प्रकट एक केंद्रीय अवसाद के रूप में और cryoEM से कम घनत्व वाले क्षेत्रों के रूप में जटिल सतह विशेषताओं। एन एस सभी चार परीक्षण के नमूने में इसी प्रकार के विपरीत पता चलता है, वहीं cryoEM पैनलों की तुलना की वजह से यह झिल्ली प्रोटीन solubilize करने के लिए डिटर्जेंट की मौजूदगी की RyR1 के निचले SNR (विपरीत) को उजागर करता है। स्फटिक बर्फ, बर्फ संदूषण, दृष्टिवैषम्य, और वेब संरचनाओं की तरह (चित्रा 3): cryoEM कलाकृतियों की विशिष्ट उदाहरण RyR1 के लिए दिखाए जाते हैं। उनके कारणों और रोकथाम आगे की चर्चा खंड में वर्णित हैं। जमे हुए हाइड्रेटेड RyR1 के स्पा और 3 डी पुनर्निर्माण प्रोटीन की homotetrameric संगठन (चित्रा -4 ए) को दर्शाता है जो अपने चौगुना सममित संरचना, पता चलता है। साइटोप्लास्मिक डोमेन 3 275 X 275 X 120 के एक वर्ग चश्मे रूपों और एक पाड़ की तरह संरचना के गठन कई प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गोलाकार डोमेन के होते हैं। ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन 115 X 115 X 60 3 अधिकतम आयामों के साथ एक छोटे पतला वर्ग चश्मे रूपों। 10 एक प्रस्ताव पर यह helices अल्फा (4B चित्रा) कल्पना करने के लिए संभव है। 3 डी का अंतर मानचित्रण, इस मामले में, एक 12 केडी प्रोटीन विचार के FKBP12 के 3 डी फर्क नक्शा महत्वपूर्ण ligands की स्थिति प्रकट कर सकते हैंRyR1 के लाल एक सबयूनिट, RyR1 (चित्रा 4C) 29 पर आरोपित किया गया है। अंत में, गठनात्मक परिवर्तन macromolecule के एक गतिशील दृश्य प्रदान करते हैं। इस मामले में RyR1 पहले से खुले राज्य (चित्रा 4D) 27 को बंद से एक जन स्थानान्तरण बंद है या खुला या तो स्थितियों में पता चलता है स्थिर हो। क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक की चित्रा 1. प्रवाह आरेख। आरेख प्रोटोकॉल का मुख्य चरणों पर प्रकाश डाला गया। नमूनों की एक किस्म के लिए एन एस और cryoEM 2. तुलना चित्रा। (ए) AAV5, एक icosahedral वायरस। एक चक्करदार वायरस (बी) TMV,। Insets 23 ए की पेचदार दोहराने, दिखाते हैं। (सी) के मूल निवासी KLH। (डी) RyR1; प्रतिनिधि विचारों (च, चौगुना देखें और एस, साइड देखें) डाला जाता है। सभी नमूनों कम खुराक की शर्तों के तहत और 200 केवी का एक त्वरक वोल्टेज के तहत 50,000X एक का एक ही बढ़ाई imaged हैं। स्केल सलाखों, 10 एनएम। सभी एन एस नमूने कार्बन समर्थन पर कर रहे हैं, cryoEM नमूने ए, सी, डी quantifoil अधिक पतली कार्बन पर हैं, और cryoEM नमूना बी quantifoil छेद पर सीधे है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा एक RyR1 cryoEM नमूना पर आम cryoEM कलाकृतियों दिखा छवियों के 3. गैलरी। (ए) क्रिस्टलीय बर्फ। (बी) आइस संदूषण (तीर)। (सी) दृष्टिवैषम्य। विदृष्टिक छवि में RyR1s मुश्किल से दिखाई दे रहे हैं। सही पर इनसेट शक्ति SPECT से पता चलता हैअसममित Thon के छल्ले के साथ छवि की रम। बाईं तरफ इनसेट संदर्भ के लिए एक गैर-विदृष्टिक छवि की शक्ति स्पेक्ट्रम को दर्शाता है। (डी) वेब संरचनाओं की तरह। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। Ryanodine रिसेप्टर 4. CryoEM और 3 डी पुनर्निर्माण चित्रा। । (ए) Isosurface प्रतिनिधित्व (बी) परमाणु निर्देशांक और cryoEM लिफाफा के बीच अच्छा समझौता दिखा RyR1 के एन टर्मिनस 30 की एक क्रिस्टल संरचना की डॉकिंग; तीर संरचना से बहर कि दो helices अल्फा को इंगित करें। Arrowhead आयन चैनल के ध्यान में लीन होना है कि चारों ओर चार helices में से एक को इंगित करता है। बिंदीदार लाइनों झिल्ली की सीमाओं से संकेत मिलता है। (सी) RyR1 और 3 डी लोFKBP12 लिगेंड (नारंगी रंग) की कटियन। (डी) ओपन (काला जाल) रचना के लिए बंद (नारंगी) से जाने में RyR1 के गठनात्मक परिवर्तन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

स्पा द्वारा पीछा मंदिर एक दिया macromolecule के लिए, एक कम संकल्प 3 डी संरचना पहले एक higher- द्वारा पीछा किया जा सकता है, जो एन एस डेटा, से निर्धारित किया जाता है, सामान्य तौर पर मध्य 2014 तक EMDB में 2000 प्रविष्टियों में होने जा रही है, कई macromolecular 3 डी संरचनाओं योगदान दिया है संकल्प cryoEM 3 डी संरचना। पहली 3 डी पुनर्निर्माण की सुविधा है, जो एन एस, द्वारा प्रदान की आणविक सीमाओं की उच्च विपरीत, बाद में इसकी इसकी पूरी तरह से हाइड्रेटेड राज्य में macromolecule की आंतरिक संरचना को मैप करने की क्षमता है, और बहुत उच्च संकल्प को प्राप्त करने की संभावना के साथ cryoEM से परिष्कृत किया जाता है। CryoEM का एक और लाभ macromolecule के पतन में परिणाम सकता है कि निर्जलीकरण तनाव का उन्मूलन है। इसके अलावा, संभव सतह अवशोषण प्रभाव समाप्त और macromolecule समाधान में गोद ले कि रचना से पता चलता है जो कार्बन समर्थन, न आना करने की संभावना नहीं है। क्रायो-नकारात्मक धुंधला, cryoEM और एन एस का एक संयोजन, एक पूरी तरह से Hyd में उच्च विपरीत परमिटनमूना मूल्यांकन और दाग खुद macromolecule ³¹ की अखंडता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि यह भी हिस्से में, कम से कम 10 EMDB प्रविष्टियों के साथ, लेकिन यह कम बार इस्तेमाल किया गया है, एसपीए का उपयोग कर 3D पुनर्निर्माण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। 3D पुनर्निर्माण के लिए अनुकूल दो अन्य मंदिर तकनीक 2D इलेक्ट्रॉन क्रि और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी हैं। 2 डी इलेक्ट्रॉन क्रि एक planar या ट्यूबलर क्रिस्टल की आवश्यकता है; क्रिस्टल की इलेक्ट्रॉन विवर्तन संभावित परमाणु संकल्प ³² के लिए अग्रणी 3D पुनर्निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है। Vitrified या पारंपरिक रूप से तय नमूनों की इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी में, एक macromolecule या उप सेलुलर घटक विलक्षण वस्तुओं खंगाला जा सकता है कि लाभ के साथ, बाद में tomographic पुनर्निर्माण ³³ के लिए मंदिर के अंदर घुमाया जा रहा है; हालांकि वर्तमान में इस तकनीक को एक ^34,35 40-20 लेकर एक संकल्प सीमा होती है। इन सभी आणविक मंदिर तकनीकों के अलावा, एन एस और cryoEM डेटा के स्पा सबसे व्यापक रूप से किया गया हैइस्तेमाल किया। यहाँ सचित्र प्रोटोकॉल एसपीए के विश्लेषण के लिए उपयुक्त cryoEM छवियों को प्राप्त करने के लिए समर्पित है; फिर भी प्रोटोकॉल के अधिकांश भी cryoEM 2 डी के क्रिस्टल और tomographic नमूने के लिए लागू है।

एक सफल cryoEM सत्र में कई महत्वपूर्ण कदम के संयुक्त सफलता पर निर्भर करता है; महत्वपूर्ण पहलुओं को ध्यान में रखना आम cryoEM कलाकृतियों की व्याख्या करने और उन्हें निम्नलिखित पैराग्राफ में वर्णित हैं से बचने के लिए कैसे करने के लिए। इस अनुभाग में भी एसपीए विधि का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए डेटा संग्रह के दिशा निर्देशों का वर्णन करता है।

बर्फ क्रिस्टलीय को संक्रमण से बचें। एक केंद्रीय पहलू नमूना क्रायो डूबनेवाला मंदिर अवलोकन भर के क्षण से कांच का राज्य में रहने की जरूरत है। इस प्रकार तरल एटैन में नमूना डूबनेवाला के बाद बाद के सभी चरणों को तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) या तरल हीलियम (-269 डिग्री सेल्सियस) तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं। -135 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के लिए वार्मिंग में कांच का पानी बदल देती हैक्रिस्टलीय पानी के लिए; फिर macromolecular rearrangements जगह ले सकता है और पानी क्रिस्टल छवि (चित्रा 3A) हावी; नमूना खारिज किया जाना चाहिए। हैंडलिंग चिमटी अपर्याप्त पूर्व थे अगर दुर्घटना नमूना वार्म अप क्रायो डूबनेवाला, मंदिर में (एक gridbox द्वारा संरक्षित भी अगर) कंटेनर, और / या क्रायो धारक प्रविष्टि के बीच जमी ग्रिड का हस्तांतरण भी धीमी गति से कर रहे हैं हो सकता है, या कर सकता है ठंडा। क्रायो-हस्तांतरण पर मंदिर में महत्वपूर्ण वैक्यूम गिरावट (ठंड नमूना जाल गरम आने वाली हवा) भी नमूना तक गर्म हो सकता है। अंत में, अधिक विकिरण का नमूना भी बर्फ क्रिस्टलीय के लिए संक्रमण में परिणाम सकता है।

बर्फ संदूषण को कम। छोटा सा नमूना मात्रा (3-5 μl) मंदिर ग्रिड के लिए लागू देखते हुए, वाष्पीकरण बफर घटकों (नमक, डिटर्जेंट) ध्यान केंद्रित करने और इस प्रकार multimeric राज्य के नुकसान सहित macromolecular अखंडता को प्रभावित कर सकता है। एक उच्च सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) microenvironment या चैम्बर दरकिनारइस समस्या। वैकल्पिक रूप से क्रायो डूबनेवाला एक पर्याप्त हवादार पर्यावरण ठंडे कमरे में किया जा सकता है। क्रायो डूबनेवाला आरएच के बाद खुद को एक ठंड जाल के रूप में कार्य करता है क्रायो ग्रिड के रूप में, बर्फ संदूषण, या क्रायो ग्रिड पर परिवेश नमी का संक्षेपण को रोकने के लिए संभव के रूप में कम किया जाना चाहिए। आइस संदूषण उच्च विपरीत और 5 ~ के बीच एनएम लेकर आकार और के साथ हस्तक्षेप या यहां तक ​​कि पूरी तरह से छवि ब्लॉक कि कई माइक्रोन के साथ कोई बुनियाद के साथ कणों के होते हैं। हवा स्थानांतरण के दौरान क्रायो ग्रिड की दिशा में साँस लेने / बात कर, हवा ड्राफ्ट से बचें, और परिवेश आरएच कम। (सफेद निलंबित कणों के रूप में दिखाई) गाढ़ा पानी के साथ ओपन तरल नाइट्रोजन कंटेनर भी खारिज किया जाना चाहिए।

Macromolecular झुकाव / विचार अधिकतम करें। नमूना समर्थन के लिए, किए जाने के लिए एक विकल्प सच छेददार ग्रिड और छेददार ग्रिड से अधिक पतली कार्बन के बीच है। यह नमूना कार्बन छेद बनाम कार्बन फिल्म में फैलता कैसे (मैं), (द्वितीय) उपलब्ध नमूना conce पर निर्भर करता हैntration, के रूप में नंगे छेद छवि पर एक समान कण घनत्व के लिए कार्बन समर्थन की तुलना में अधिक एकाग्रता के 100X आवश्यकता हो सकती है (~ से 0.02 माइक्रोन से 2), और (iii) macromolecule झुकाव का वितरण कैसे यादृच्छिक है। कार्बन हाइड्रोफिलिक बनाता है जो कि चमक निर्वहन, नोट, सभी तीन पहलुओं में एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा और इस नमूने पर निर्भर हो जाएगा। उच्च संकल्प के लिए 3 डी पुनर्निर्माण को परिष्कृत करते समय एक आवर्तक देखें यादृच्छिक शंक्वाकार पुनर्निर्माण द्वारा प्रारंभिक संरचनात्मक निर्धारण के लिए वांछनीय है, जबकि macromolecule के उन्मुखीकरण के बारे में, macromolecular विचारों के randomness वांछनीय है। हमारे उदाहरण में, RyR1 पसंदीदा 'चौगुना' दृश्य (चित्रा 2 डी) के साथ कार्बन के साथ सूचना का आदान प्रदान और झुकाव के randomness और उच्च संकल्प ³⁶ के लिए छेददार ग्रिड की आवश्यकता है।

SNR है। SNR बढ़ाने के लिए सबसे अच्छी रणनीति शोर की पृष्ठभूमि के स्रोतों को कम करने के लिए है अधिकतम करें। अत्यधिक बर्फमोटाई और क्या जरूरत है परे कार्बन फिल्म मोटाई का समर्थन और प्रोटीन अतिरिक्त शोर जोड़ देगा एम्बेड करने के लिए (यदि उपस्थित हो)। इस प्रकार बर्फ की मोटाई सोख्ता समय, दबाव, आरएच, और फिल्टर पेपर की गुणवत्ता को नियंत्रित करने से न्यूनतम आवश्यक करने के लिए कम किया जाना चाहिए। कार्बन समर्थन के लिए, एक पतली (~ 5 एनएम) कार्बन फिल्म मोटा छेददार कार्बन फिल्म पर स्तरित है: नमूना पतली कार्बन से ढके छेद पर imaged है, जबकि मोटी छेददार कार्बन यांत्रिक प्रतिरोध प्रदान करता है। दूसरी ओर, कि अत्यंत पतली बर्फ ध्यान दें और / या कार्बन एक वेब (चित्रा 3 डी) में बदल सकते हैं कि एक आसानी से टूट समर्थन में हो सकता है। SNR को अधिकतम करने के लिए, किसी भी अनावश्यक बफर घटकों से बचा जाना चाहिए। झिल्ली प्रोटीन के लिए, डिटर्जेंट इसके विपरीत पर एक महत्वपूर्ण टोल (चित्रा 2 डी, सही पैनल देखें) लेता है। सतह के तनाव को कम करने से इसके अलावा डिटर्जेंट नमूना समर्थन पर फैलता है जिस तरह बदल जाता है। कुछ झिल्ली प्रोटीन det के अलावा लिपिड की उपस्थिति की आवश्यकताआगे इसके विपरीत कम कर देता है जो ergent,। इस नमूने काबू पाने के लिए सिर्फ ³⁷ क्रायो डूबनेवाला से पहले कम डिटर्जेंट एकाग्रता के साथ और लिपिड के बिना एक बफर में पतला किया जा सकता है। नए वैकल्पिक डिटर्जेंट ¹⁶ और transmembrane डोमेन घटक को स्थिर करने के nanodisks ³⁸ के उपयोग cryoEM द्वारा इमेजिंग झिल्ली प्रोटीन के लिए सफल दृष्टिकोण होना दिखाई देते हैं।

उच्च गुणवत्ता के चित्र के लिए प्रयास करते हैं और CTF सुधार के लिए तैयार करते हैं। Vitrified नमूनों, जिस पर कोई नहीं है इंगित, CTF, आवृत्ति को तीव्रता से संबंधित है कि समारोह, कई शून्य संक्रमण है, जहां विपरीत पर्याप्त छवि (चरण) उत्पन्न करने के लिए उच्च defocus मूल्यों की आवश्यकता इंफॉर्मेशन। CTF सुधार कम संकल्प 3D पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक नहीं है जबकि उच्च संकल्प के लिए लक्ष्य, जब 3D वस्तु का सही प्रतिनिधित्व ठीक करने के लिए, विभिन्न defoci साथ छवियों कम्प्यूटेशनल CTF सुधार किया जा सकता है, ताकि एकत्र करने की आवश्यकता है।CTF दृढ़ संकल्प और सुधार प्रमुख एसपीए सॉफ्टवेयर संकुल ^07/04 में शामिल है; विवरण कहीं और ³⁹ पाया जा सकता है। इष्टतम CTF सुधार के लिए, defoci की एक सीमा का उपयोग करें। एक अच्छी रणनीति 3-4 defocus मूल्यों के बीच वैकल्पिक करने के लिए है। मूल्यों, बर्फ / कार्बन मोटाई (पतले नमूना कम defocus की आवश्यकता है), और वोल्टेज (कम वोल्टेज कम defocus की आवश्यकता है) macromolecule (बड़े आकार कम defocus की आवश्यकता होती है) के आकार पर निर्भर करते हैं। 200 केवी के लिए, मूल्यों का एक अच्छा प्रारंभिक सीमा 2.5, 3, 3.5 और 4 माइक्रोन defocus है। CTF पारस्परिक अंतरिक्ष प्रतिनिधित्व, बिजली स्पेक्ट्रम में (Thon ⁴⁰ छल्ले) उच्च और निम्न तीव्रता के छल्ले बारी के रूप में प्रकट होता है। समाधान के लिए संभावित खोलेगा बिजली स्पेक्ट्रम प्रदर्शित; व्यापक दिखाई दे Thon अंगूठी की आवृत्ति प्राप्य संकल्प की एक प्राथमिकताओं का अनुमान है सबसे करीब है। बिजली स्पेक्ट्रम समय-समय पर जाँच की, और विदृष्टिक (गैर परिपत्र) Thon छल्ले किया जाना चाहिए (चित्रा 3सी) उद्देश्य stigmator साथ सही किया जाना चाहिए। Thon छल्ले कम से कम वांछित संकल्प अप करने के लिए दिखाई जानी चाहिए।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त एक cryoEM डाटासेट सीधे एक 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के क्रम में स्पा द्वारा संसाधित किया जा सकता है। यहां तक ​​कि एक आदर्श नमूना के साथ, 3 डी पुनर्निर्माण की गुणवत्ता प्रदर्शन और मंदिर उपकरणों की विशेषताओं पर निर्भर करती है, और छवि प्रसंस्करण पर होगा। इन दोनों मोर्चों में, और हाल ही में विकसित प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों के लिए विशेष रूप से उल्लेख के साथ जारी रखा सुधार के साथ, संभावना अधिक लगातार परमाणु प्रस्ताव पर 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त यह कभी किया गया है की तुलना में करीब है।

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ethane	Airgas	371745	99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable
Liquid nitrogen	Airgas	27135	99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers	Ted Pella	5326
Mica sheets, 1 x 4 cm	Ted Pella	54
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type	Electron Microscopy Sciences	70220-45
350 ml cryo-dewars	Pope	8600
Cu 400 mesh holey grids  Quantifoil	Quantifoil	Q10525
Cu 400 mesh holey grids C-Flat	Protochips	CF-1.2/1.3-4C
Glow discharge device	Electron Microscopy Sciences	Model E7620
Turbo pumping station	Gatan	Model 655
Carbon evaporator	Denton Vaccum	Model 502B
Freeze plunger	FEI	Vitrobot Mark IV
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT			http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Image Processing software EMAN			http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Image Processing software Spider			http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Image Processing software Freealign			http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
3D visualization software Chimera			http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin	Biosyn