Summary
Líneas celulares de cáncer inmortalizadas pueden ser cultivadas como cultivos de células en 3D, un modelo valioso para la investigación biológica. Este protocolo describe imágenes espectrometría de masas de cultivos de células en 3D, incluyendo mejoras en la plataforma de preparación de la muestra. El objetivo de este protocolo es instruir a los usuarios preparar cultivos de células en 3D para el análisis de imágenes de espectrometría de masas.
Protocol
1. 3D cultivo celular y preparación de la Imagen
- Cultura una línea celular apropiada, es decir, colon HCT116 línea celular de carcinoma, en dos dimensiones, cultivo en monocapa.
- Crecer HCT 116 células en un matraz T-25 con los medios de McCoy 5A + suero bovino fetal al 10% en un incubador de CO2 al 5% hasta 50-70% de confluencia, que toma generalmente unos pocos días.
- Células liberan con solución de tripsina-EDTA 0,25% y cuentan una parte de las células utilizando un hemocitómetro y tinción con azul de tripán para comprobar la densidad celular y viabilidad.
- Después de conteo, diluir las células con medio completo para lograr una densidad de siembra apropiada de 6.000 células / pocillo, o 30.000 células / ml.
2. Preparar agarosa revestidos placas de 96 pocillos
- Añadir 0,19 g de agarosa a 10 ml de medios estándar en un tubo cónico de 50 ml (solución de agarosa al 1,5% en medios de comunicación) 10. Asegurar la incorporación por mezcla suave. Autoclave la agarosa en un baño de aguadurante 20 min.
- Con una pipeta multicanal, aspirado 50 l de la mezcla de agarosa + medios de comunicación en los 60 pozos centrales de la placa de cultivo de placa de fondo 96 plana. Como los pozos en los bordes periféricos de la placa tienen ligeramente más altas tasas de evaporación, añadir 200 l de fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) en lugar de la agarosa a estos bordes.
- Una vez que la mezcla de agarosa se ha añadido a los pozos internos, ajuste el plato a un lado enfriar a ~ 37 ° C antes de la adición de las células.
3. Las semillas y cuidar el cultivo tridimensional
NOTA: Más o menos células se pueden sembrar en función de los requisitos de la cultura involucrados, pero se ha determinado que estas condiciones resultan en estructuras de cultivo de células en 3D de aproximadamente 1 mm de diámetro después de 10-14 días de cultivo (datos no mostrados) .
- Añadir 200 l de la solución celular apropiado (diluido para contener ~ 6000 células) a la agarosa recubiertaPlaca de 96 pocillos. Cubrir la placa y poner en incubador humidificado con 5% de CO2 a 37 ° C para el crecimiento celular.
- Cambie medio celular un mínimo de cada 48 horas, o cuando aparezca el medio que se va cambiando de color.
- Cambio de medio por aspiración cuidadosamente los viejos medios de todo el pequeño cultivo de células 3D (visible a simple vista por día 2) en la parte inferior de la agarosa. Añadir 200 l de medio fresco suavemente sobre el cultivo celular en 3D.
- (Paso opcional) Durante estos cambios de medio, añadir quimioterapia u otros medicamentos para la prueba. Diluir el fármaco de elección a la concentración final con medio completo y añadir los necesarios 200 l a cada pocillo.
- Monitor 3D de crecimiento de cultivo de células mediante microscopio óptico, hasta que los cultivos de células 3D son aproximadamente 1 mm de diámetro.
4. Cosecha los Cultivos Celulares 3D
- Use un 2 ml pipeta serológica para eliminar suavemente el cultivo de células en 3D de la cama de agarosa. <li> Lavar los cultivos de células en 3D con PBS pipeteando suavemente en aproximadamente 1 ml de PBS en una placa de espera de 24.
- Transferencia cosecha cultivos de células en 3D a través de una pipeta serológica a tubos de centrífuga de proteína o metabolito de extracción, o incrustarlos en un medio de corte para ayudar a cortar para aplicaciones de imagen.
5. Integrar los cultivos celulares 3D en gelatina
- Preparar una solución de ~ 175 mg / ml de gelatina en agua de alta pureza (18 MΩ preferido). 22,23 Mezclar la gelatina con vigor. Observe la solución convertirse viscoso y difícil de manipular. Coloque el tubo cónico que contiene gelatina en un baño de agua a ~ 60 ° C y caliente hasta que la solución se vuelva clara y fácil de aspirado.
NOTA: La solución de gelatina caliente se endurece rápidamente a medida que se enfría, por lo que realizar todos los pasos siguientes rápidamente antes de la congelación. - Después se calienta, tomar la gelatina de inmediato a la campana de cultivo celular. Mantenga el tubo con la gelatina en un beaker con agua precalentado a unos 60 ° C para evitar el endurecimiento de la solución de gelatina.
- Utilizando una pipeta serológica de 2 ml, depositar 0,6 ml de la solución de gelatina caliente en el pocillo de una placa de fondo plano de 24. Este volumen es suficiente para cubrir el fondo en una capa delgada. Depositar suavemente los cultivos de células 3D inmediatamente en la parte superior de la capa de gelatina utilizando una pipeta de 2 ml diferente para evitar la ruptura de la estructura 3D.
NOTA: Se debe tener cuidado en esta etapa no colocar PBS en la gelatina. Si esto sucede, sin embargo, eliminar el PBS desde la parte superior de la gelatina utilizando una pipeta de 200 l. - Después de que los cultivos de células 3D se colocan en la superficie de la capa de gelatina, cuidadoso pipeteado otro 0,6 ml de la mezcla de gelatina caliente sobre los cultivos de células 3D, a fin de no perturbar la posición de las culturas. Después se coloca la segunda capa, la congelación de los cultivos de células 3D de gelatina embebido a -80 ° C.
6. Corta y Descongele Monte ªe Gelatina incrustado-Cultivos Celulares 3D para espectrometría de masas Imaging
- Retire la placa de 24 pocillos que contienen los cultivos de células en 3D desde el congelador. Calentar la parte inferior de la placa con el calor de la mano hasta una pinza o un bisturí se deslice suavemente hacia abajo el lado del pozo.
- Suavemente deslice la pinza o un bisturí, liberando la gelatina sin descongelar el centro. Tome una gota de agua para el apoyo criostato y usar esto para adherir el disco de gelatina al soporte.
- Cultivos de células 3D incrustados en gelatina son más susceptibles de cortar a -30 ° C. Limpiar la cuchilla criostato y vidrio con etanol al 70% antes de su uso. Use una parte distinta de la hoja o una cuchilla nueva para cada disco cultura-gelatina celular 3D para evitar embotamiento de la hoja.
- Utilizando el criostato, cara suavemente el exceso de gelatina hasta que los cultivos de células 3D se hacen visibles.
- En este punto lentamente cortar los cultivos de células en 3D con un movimiento suave de 12 a 16 micras secciones.
NOTA: Los factores críticos a rebanar incluyen la distancia del vidrio a la hoja, el ángulo de la hoja, la temperatura del criostato, y el ángulo del disco sobre el soporte, por lo que todos ellos se debe comprobar para asegurar resultados consistentes. - Descongelar cuidadosamente las rebanadas y montarlos en óxido de titanio (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertas de indio etiquetados adecuadamente y guárdelo en un desecador. Utilice las rodajas lo más rápido posible para obtener la máxima calidad.
Aplicación 7. Matriz y Preparación de muestras para MALDI Imaging
- Antes de las imágenes MALDI, preparar las rebanadas con la matriz apropiada.
- Para análisis de moléculas pequeñas, generalmente se requiere ningún paso de lavado. Para la detección de la proteína intacta, lavar las rodajas en frío 100% de acetona, el fluido de Carnoy, o 70% / 95% de isopropanol para eliminar las pequeñas moléculas tales como lípidos que podría enmascarar la señal de 24 - 26.
- Lave con cuidado para no más de 30 segundos a la vez. Nomolestar a algún segmento.
- Preparar la matriz en una solución de disolvente orgánico y agua, con 0,1% de TFA. Para la pequeña molécula tal como α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), utilizar 60% de ACN: 40% H 2 O: 0,1% de TFA (10 mg / ml). Para la detección de proteínas, tales como el ácido sinápico (30 mg / ml), utilizar la misma solución de disolvente. Para solubilidad óptima del ácido sinápico, disolver primero en acetonitrilo antes de la adición del TFA: H 2 O solución. Otras matrices se pueden utilizar según sea apropiado.
NOTA: Matrix se puede aplicar con varios métodos diferentes, pero debe tenerse en cuenta se han encontrado algunas matrices de co-cristalizar con la gelatina, tal como ácido ferúlico, haciendo que la muestra inutilizable. Cristales más pequeños producen espectros de masas más consistente, lo que permite más especies moleculares para ser detectado y atribuido a diferencias biológicas en lugar de los efectos de matriz. - Aplicar la matriz por el método handspotting.
- Use una jeringa con punta fina para aplicar 0,5 l de la matrsolución ix en la rebanada de cultivo de células en 3D y permite la matriz a cristalizar.
- Como alternativa, utilice el método aerógrafo. Llene un aerógrafo de calidad comercial con la solución de matriz.
- Sostenga el pulverizador 8.12 pulgadas de distancia de la diapositiva, apuntar una pulverización fina en el segmento. En entre pasadas, permita que la matriz se seque durante 1 min para permitir la mejor formación de cristales. Hasta 10-20 pasadas del aerógrafo se requiere para producir una capa óptima de matriz 22.
- Como alternativa, utilice el método de sublimación detalla en otras partes. 25,27
- Diapositivas seca en un desecador durante al menos 30 min antes de MALDI-MSI, independientemente del método de aplicación de la matriz. 25
8. MALDI-MSI Análisis Utilizando un sistema MALDI-TOF (es decir, AUTOFLEX III)
NOTA: Esta sección contiene instrucciones y consejos para establecer los parámetros para un experimento de imágenes MALDI-TOF. Dependiendo de las insfabricante y el software utilizado instru-, el proceso puede variar.
- Colocar los portaobjetos en un adaptador hecho para sostener con seguridad 75 mm diapositivas x 25 mm a la imagen las rodajas de cultivo de células en 3D adjuntado a las diapositivas recubiertos de ITO. Cargue el adaptador de diapositivas en el instrumento.
- Prepare el instrumento para MALDI-MSI, puede seleccionar un estándar de calibración adecuado para el rango de masas en cuestión. Para interrogatorio de pequeñas moléculas, las señales detectadas que corresponden a la matriz utilizada, α-CHCA, son un grupo común de calibradores. Para el análisis de las proteínas, se seleccionan patrones de proteína conocida (es decir, la ubiquitina, tripsinógeno) en el rango de masas de interés y manchado adyacente a los cultivos celulares 3D como calibradores. Calibre el instrumento antes de continuar con el desarrollo del método.
- Antes de las imágenes, el desarrollo de métodos de adquisición de datos para el rango de masas de elección mediante el software proporcionado por el fabricante del instrumento. Ver las figuras 1 y 2 parapequeña molécula y de formación de imágenes de proteínas. Para imágenes molécula pequeña, utilice reflectrón modo para la más alta resolución de masas.
- Ajuste el rango de masas para la adquisición de datos de moléculas pequeñas entre 100-1.000 m / z y de proteínas entre 8,000 25,000 m / z. Ajuste el rango de masas para abarcar la región de elección mientras que proporciona la resolución más alta masa posible con el instrumento.
- Ajuste la potencia del láser, la frecuencia, el número de disparos de láser y tamaño de punto que utilizan la solución de calibración y un cercano rebanada cultivo celular 3D 'sacrificio'. Observar estos ajustes en el software de control principal instrumento. Utilice la siguiente configuración como punto de partida recomendado: 60% de potencia, 400 disparos de láser, ultra-pequeño tamaño del punto. Estos ajustes variarán de instrumentos y métodos, de modo de optimizar los parámetros del instrumento para dar a los espectros de alta calidad para cada instrumento específico. Otros parámetros que se pueden ajustar incluyen la ganancia del detector, frecuencia de muestreo, y la ganancia electrónica. Save este método para su uso en el software de imagen (es decir., Método autoexecute que FlexImaging aprovechará).
NOTA: iones Suprimir debajo de la gama de masa de interés (de nuevo encontraron en el control de instrumentos) a fin de no interferir con la detección. - Desarrollar métodos de adquisición de datos de proteínas para el rango de masas de elección. Siga los mismos pasos descritos anteriormente, pero para los rangos de masa-medias y altas, por encima de aproximadamente 3 kDa, utilice el modo lineal.
NOTA: los ajustes difieren de los utilizados para los métodos de moléculas pequeñas.
- Parámetros de los instrumentos de configuración específicos de EM utilizando el software de imagen proporcionada por el fabricante del instrumento, como FlexImaging para sistemas de Bruker MALDI-TOF.
- Crear un nuevo archivo de imágenes y la carpeta, usando los métodos desarrollados previamente y guardado. Seleccione los parámetros del instrumento tales como tamaño de punto de trama (el cambio desde el valor predeterminado 200 micras a 50 micras), podrá establecer el método de control de instrumentos (instalación del paso 8.3.2 o 8.3.3), y posición donde para escanear el cultivo de células en 3D.
- Seleccione tres puntos enseñar apropiadas en la muestra, se mueve el láser para cada uno de ellos. Obtenga la fotografía óptica desde el software de control del láser MALDI-TOF utilizando 'Imprimir pantalla'.
NOTA: Muchos programas de software de formación de imágenes requieren una fotografía óptica de la muestra de "enseñar" el software donde se encuentra el láser, que se puede obtener con un escáner o una cámara a menudo el instrumento.
- A continuación, iniciar el proceso de formación de imágenes del software de imagen (no el control de instrumentos) y adquirir los espectros de masas de cada rebanada. Observe mayoría de las masas de todo el cultivo de células en 3D y otras localizadas en áreas particulares.
9. Métodos de análisis de datos opcionales
- Para el análisis objetivo, ejecutar el análisis manual de los espectros haciendo clic en una masa en el espectro medio, o permitir que el software de imágenes para recoger automáticamente masas por encima de un umbral determinado (por ejemplo., Picos above el umbral superior al 20%). Para el control de calidad, examinar la distribución de los picos de la matriz o el espectro media.
- Realizar análisis estadísticos con datos extraídos de software matemático como R o Matlab.
- Exportación espectros solo en formato ASCII, un archivo de texto legible, para cargar en el software de su elección.
- Convertir los espectros individuales a ASCII, mzXML, de formato mzML para la lectura de varios programas de software diferentes, 28 -. 31 o exportar los datos como un Analizar (.img) archivo de formato, un formato común utilizado para otras aplicaciones de imagen como la resonancia magnética 32 Dos opciones de código abierto para el análisis son MSiReader y BioMap 32,33.
- Una vez que los archivos se exportan en un formato legible por el software, cargar el conjunto de datos a través de las instrucciones del software respectivo. Después de la carga, un tratamiento posterior a la adquisición, tales como la eliminación de línea de base y la normalización.
- Con este conjunto de datos, realice Statitratamientos stical tales como el análisis de componentes principales de la agrupación jerárquica ya sea utilizando scripts o construidas en los algoritmos de software como Matlab 18 personalizados.
Representative Results
Formación de imágenes MSI tiene el potencial para revelar muchos distribución molecular diferente en cultivos de células 3D. Utilizando el método descrito anteriormente, las especies de moléculas pequeñas (Figura 1) a las proteínas grandes (Figura 2) pueden ser rastreados a través de la cultura. Estos resultados muestran la visualización de un solo ion con la herramienta gratuita MSiReader. 32 Los resultados pueden ser analizados para los iones individuales de interés a través del cultivo de células 3D con software de visualización, ya sea en una región de interés o la totalidad de la región escaneada. Además la mayoría de software visualizará automáticamente iones por encima de un determinado umbral fijado por el usuario, lo que puede ayudar a los esfuerzos de descubrimiento. Una vez que se obtienen mapas individuales de iones, la mayoría del software incluye la capacidad de superponer las imágenes para ver la colocalización de iones. Ya sea en enfoques basados en el descubrimiento o de una manera específica, de formación de imágenes espectrometría de masas es una herramienta poderosa para analizar cultivos de células 3D.
Figura 1. Los resultados representativos de crecimiento del cultivo celular 3D y seccionamiento. Izquierda) Imagen óptica de una estructura de cultivo de células intactas HCT-116 3D colorrectal como se ve en el día 14 antes de la cosecha. Derecha) Imagen Óptico de una rodaja de aproximadamente ecuatorial de un colorrectal deshielo cultivo celular 3D montada sobre un portaobjetos recubiertos de ITO para la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los resultados representativos de molécula pequeña MALDI-MSI de una sección ecuatorial de un cultivo de células 3D. Top) los espectros de masa media alcanzada con α-CHCA en la gama baja de masas (pequeña molécula). Bottom) Imágenes representativas deuna sola masa: 327,8 m / z localiza principalmente en el interior del cultivo celular en 3D y 429,7 m / z localizada principalmente en el borde del cultivo celular en 3D. La línea de puntos indica el borde aproximada del esferoide. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los resultados representativos de formación de imágenes de proteínas por MALDI-MSI de una sección ecuatorial de un cultivo de células 3D. Top) los espectros de masa media alcanzada con ácido sinápico en el (rango de proteína) de masa superior. Bottom) Imágenes representativas de una sola masa: 10.871 m / z localizada principalmente en el borde del esferoide, y 12.184 m / z localizada más hacia el interior del esferoide. La línea de puntos indica el borde aproximada del esferoide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Utilizando los métodos descritos anteriormente, los cultivos celulares pueden cultivarse en 3D y se analizaron con MALDI-MSI. Muchas líneas celulares inmortalizadas formarán estructuras 3D cuando se cultivan adecuadamente 9,10. Se debe tener cuidado para cultivar células que no se han pasado demasiadas veces, es decir, tener bajos números de paso. En general, las células con un número de paso de diez e inferior son óptimas para el crecimiento de los cultivos de células en 3D. Crecimiento de los cultivos de células en 3D en un soporte de agarosa tradicional proporciona una manera rentable para los grupos de investigación interesados en el cultivo de células en 3D para probar este sistema. Este método utiliza algunos componentes no ya en la mayoría de los laboratorios de cultivo de células de mamíferos. Es necesario prestar cuidadosa atención a la preparación de las placas de agarosa para el crecimiento de manera que los cultivos celulares 3D son compatibles en tamaño y forma; algunos aspectos que requieren una cuidadosa atención incluyen la comprobación de que no hay burbujas de aire quedan atrapadas a la mezcla y que un menisco adecuado se forma en la parte inferior de cada well. Si el menisco no se forma correctamente, las células pueden crecer en formas no esferoide o en pequeños grupos. Además, debe tener cuidado de no colocar PBS en la gelatina con los esferoides cuidado. Si esto ocurre, retire el PBS desde la parte superior de la gelatina con una pipeta 200 microlitros. Si el coste no es un factor, placas de fondo redondo de unión ultra-bajas son comercialmente disponibles y ofrecen simplificación de estos pasos. Mientras que otros métodos de incrustación de tejidos también pueden ser compatibles espectrometría costoso y no masa, gelatina-incrustación se ha demostrado que ser barato y versátil. Estrategias de preparación antes mencionados han sido optimizados para cultivos de células en 3D para obtener los datos de la más alta calidad. Si bien la gelatina-incrustación se ha demostrado que ser compatible con el análisis de espectrometría de masas, este proceso hace disminuir las matrices disponibles debido a la co-cristalización. Una vez congelados, los cultivos celulares 3D son estables durante meses, siempre y cuando no se descongelan por congelación. La gelatina se vuelve opaca cuando se congela, y la célula 3Dculturas son de un color similar, por lo que es aconsejable antes de la congelación para documentar la colocación de cultivo de células en 3D para ayudar en la corte.
En la preparación de diapositivas, la matriz se puede aplicar con varios métodos diferentes, pero debe tenerse en cuenta que se han encontrado algunas matrices de co-cristalizar con la gelatina, tal como ácido ferúlico, haciendo que la muestra inutilizable. Cristales de la matriz pequeños producen espectros de masa más consistente. Mientras handspotting es el método más simple de aplicación de la matriz, el volumen de disolvente más grande puede dar lugar a tamaños de los cristales más grandes y la migración analito significativo.
En el espectrómetro de masas, los avances en las tecnologías de MALDI-MSI han reducido los conocimientos especializados necesarios para los análisis de inicio. Adquisición y análisis de datos es sencillo en la mayoría de los sistemas, lo que permite que incluso un novato para obtener información de alta calidad a partir de diapositivas recubiertos de ITO. La selección cuidadosa de los parámetros del instrumento, optimizado en la cercana sin imagen cultur celular digno 3Des, es fundamental para la obtención de datos de alta calidad. Por ejemplo, el aumento de la potencia del láser puede aumentar la intensidad del pico, pero la disminución de la potencia del láser puede mejorar la resolución y dar formas de los picos más simétricas. Cultivos de células en 3D deben utilizarse rápidamente después de rebanar para garantizar la calidad de la muestra óptima. Degradación de la señal de proteína puede ser visto en menos de una semana sin almacenamiento adecuada (desecador / -80 ° C congelador), en particular en la región de masas de alta (por encima de 20 kDa). Debido a la creciente demanda, muchos programas de software de visualización diferentes han sido desarrollados y son gratis para el público de investigación. La mayoría de los espectrómetros de masas de imagen han instalado el software necesario para visualizar masas individuales con los formatos propietarios usados en cada instrumento. Estos programas de software pueden ser utilizados para obtener imágenes de una sola masa y exportar los datos. La mayoría del software también permitirá la superposición de dos o más masas de interés. Además, muchos de los espectadores diferentes para los datos de MSI son de descarga gratuita, como un MSiReaderd BioMap 32,33 Los datos de espectrometría de masas obtenidos también pueden ser procesados después de la adquisición con facilidad, con lo que la información más útil a la vanguardia..
De farmacéuticos a los lípidos a las proteínas, el sistema descrito anteriormente permite la adquisición rápida de datos para evaluar la distribución de moléculas de interés a través de una estructura de cultivo celular en 3D. Las secciones seriadas se pueden tomar a la imagen de toda la estructura en 3D mediante la construcción de cada imagen 2D de una rebanada del cultivo celular 3D. Las técnicas y las notas en el protocolo serán de utilidad para los investigadores que desean empezar un cultivo celular tridimensional como un puente entre la cultura monocapa y modelos animales. Una vez dominado, estas técnicas se pueden aplicar a varios tipos de 3D culturas celulares, tejidos y cultivos celulares, permitiendo a los investigadores a la imagen lo que muestras que eligen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT116 Cell line | ATCC | ATCC CCL-247 | Potential hazard, handle with care |
| McCoy's 5A media | Gibco | 16600-108 | |
| Fetal Bovine serum | HyClone | SH30071.03 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA solution | Gibco | 25200-056 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010049 | |
| Gelatin, unflavored | Knox | Available at most grocery stores in single-packets | |
| ITO-coated glass slides | Delta Technologies, Limited | CG-90IN-S115 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Sinapic Acid | Sigma-Aldrich | 85429 | |
| 0.3 mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set | RoyalMax Airbrush | Many options available on sites such as Amazon.com |
References
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