This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
Disciplinen i farmakologi har använt den isolerade vävnadsbadet system för över 150 år. Mångsidig av detta system har tillåtit vetenskapsmän över hela världen för att karakterisera receptorer och receptor signaltransduktion, med denna kunskap som ligger till grund för terapier som har behandlats miljontals individer med sjukdomar eller störningar som högt blodtryck, hjärtsvikt, diabetes, mag-tarmsjukdom, urinblåsa dysfunktion, astma, och sväljstörningar, för att bara nämna några. Till denna dag återstår den isolerade vävnadsbadet en viktig aspekt av läkemedelsutveckling och grundforskning, eftersom det tillåter vävnaden att fungera som en vävnad. I den här JUPITER lektionen, är en formell protokoll delas för att visa en visuell och virtuell experiment utnyttja data från en isolerad vävnad bad experiment som mäter isometrisk kontraktion, vilket tillåter receptor karakterisering.
Den främsta fördelen med denna teknik är att vävnaden lever ettnd fungerar som helhet vävnad, med en fysiologisk utfall (sammandragning eller avslappning) som är relevant för kroppen. Det är en syntes av stegen (läkemedelsreceptorinteraktioner, signaltransduktion, andra budbärare generation, förändring i glatt muskulatur retbarhet, och ändra i vävnad funktion). Medan andra tekniker tillåter studier av vart och ett av dessa steg (t.ex. radioligandbindning för drog affinitet, mätning av andra budbärare), gör den isolerade vävnadsbadet teknik för integrering av alla dessa steg 1. En annan fördel är att behålla vävnad funktion medger beräkning av viktiga farmakologiska variabler som är mer meningsfullt i en vävnad vs en cellulär miljö; det kommer närmare hur de undersökta läkemedlen skulle fungera i kroppen som en helhet.
Mätning av isometrisk kraft som ett forskningsverktyg är över 150 år gammal, men det fortsätter att vara den prototypiska teknik för receptor karakterisering i kontraktila vävnader 2. Kraften i denna teknik är i sin enkelhet och mångsidighet: genom att spela in svar framkallat av ökande koncentrationer av en agonist i närvaro eller frånvaro av en antagonist, kan en myriad av information härledas om de farmakologiska egenskaperna för varje läkemedel och receptorn till vilken det binder 3-5. Experiment av denna typ samla även information om konkurrens kontra icke-konkurrenskraftiga arten av de antagonister som används, liksom receptor heterogenitet och icke-specifika läkemedelseffekter 6-8. Således, med enkla permutationer till denna isolerade vävnadsbad experiment kan alstras en relativt komplett farmakologiska profilen hos de receptorer som medierar agonistinducerad muskelkontraktion.
I termer av agonism, the relativa effekten (E MAX) och potens (EC50) av en agonist i en given vävnad kan beräknas och jämföras till svar från andra agonister i samma vävnad 1. I vårt experiment, råttan bröstaorta inkuberades med antingen vehikel eller α en adrenerg receptorantagonist prazosin (5 nM) under en timme före tillsats av α en adrenerg agonist fenylefrin till vävnadsbadet och alstra kontraktion. Figur 2 presenterar modifierade resultat i figur 1. De gröna svar har markerats med maximal kontraktion uppnås av PE markeras som max, ½ maximal kontraktion markerade som sådana och sedan i samband med PE koncentration som orsakade detta svar. Identifiera dessa värden är att identifiera den effektiva koncentrationen av en agonist som uppnår en halv max (50%) svar eller EC50 värde.
Olyckligtvis använder agonistberoende parameters själva att bestämma receptorbindande egenskaper kan vara komplicerat 9. Helst ytterligare experiment med receptorantagonister tillåter beräkning av två viktiga parametrar som är avgörande för att definiera samverkan mellan ett läkemedel och en receptor: det -log 10 av antagonisten dissociationskonstanten (pK B) och -log 10 i molar antagonisten koncentration som är nödvändig för att framkalla två-faldig högerförskjutning i koncentration-svarskurva (pA 2) 10. Både K B och pA 2 vinst deras användbarhet från det faktum att de är agonistoberoende värden, och förblir konstant även mellan olika vävnader 11. Från data i figur 2, kan pK B beräknas med följande ekvation och bygger på EG 50 beräknade värdena på andra ställen:
EG 50 i frånvaro av prazosin = 2 x 10 -8 M
EG 50 i presinne för prazosin = 7 x 10 -6 M
Lös för K B i följande ekvation:
log (DR-1) = log [B] – log K B
Var:
[B] = antagonistkoncentration, eller 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3
dr = förhållandet dos av EG 50 värde i närvaro av antagonist / EG 50 i frånvaro. Om det finns en högerförskjutning, kommer detta värde att vara större än ett. Alltså:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M eller 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Ersätta [B] och dr:
log (350-1) = -8 – log K B
2.54 = -8 – log KB
pKg = 10,54
Detta värde för prazosin är förenlig med de värden som erhölls när prazosin samverkar med ett α en adrenerg recepteller 12,13, vilket tyder på att den adrenerga receptorn medla kontraktion till fenylefrin är α 1 adrenerga receptorn.
Flera steg är avgörande för framgången för dessa experiment. Vävnader måste förbli i PSS efter dissekering för att förhindra förlust av vävnad livskraft. Alla isometrisk muskel beredning har en optimal längd-spänning relation som genererar maximal kraft mot passiv spänning 14,15. För experimentet beskrivs i detta protokoll, var optimal passiv spänning som tidigare bestämts genom att kort lägga steg om 0,5 g passiv spänning till vävnaden. Vävnaden bör inledas utan tonen och sedan efter 30 min av jämvikts, var vävnaden utmanas med en maximal koncentration av KCl (80 mM), vilket genererade aktiva tonen. Därefter ades vävnaden tvättades och tilläts återvända till baslinjen tonen. Efter 15 min vid baslinjen tillsattes ytterligare 0,5 g passiv spänning placerad och denna process upprepas tills en platå avaktiv spänning uppnåddes med ytterligare passiva spänning. I preliminära experiment, var 4 g totalt passiv spänning fast beslutna att uppnå maximal aktiv spänning generering i aortaringar, och därmed denna totala mängden spänning läggs på ringarna innan jämvikt. Procedurmässigt är det bäst att noll tidigare passiva spänning ansökan, men kan göras när som helst före experimentet. Över stretching vävnader, vid någon punkt i experimentet eller dissektion, kommer att negativt påverka vävnadsviabilitet och experimentella resultat. Detta är mest viktigt när du placerar vävnader i badet, eftersom detta steg har den högsta sannolikheten för överdriven stretch. Adekvat tvätt, i antal och längd krävs för reproducerbara effekter. En andra utmaning för tidigt efter en inledande utmaning, eller före vävnader har återvänt till baslinjen spänning, kommer att resultera i avvikande svar. Om studera reversibla antagonister / hämmare bör vävnader inte tvättas före agonist dessutom som inhibitor koncentrationen kommer att minska.
Det finns noter fördelar och nackdelar med de isolerade vävnadsbad analyser.
Nackdelar: Vävnader kan uppleva olika grader av skador under kirurgiskt avlägsnande eller placering av ringar på krokar. Eftersom endotelceller är den inre delen av aortaringen, måste man se på placeringen av ringen på krokar för att inte skada denna cellager. Vävnader kan också ha helt olika längder av tid som de är livskraftiga i vävnaden badet, och detta måste bestämmas; inte alla vävnader är desamma. Längs dessa linjer kan vävnaderna förändras i deras lyhördhet under hela dagen så att tidskontroller blivit en nödvändig kontroll för varje experiment. Ett bra exempel på detta är den luftstrupe från marsvin som förbättrar i maximal kontraktilitet med 100% under en typisk 8 tim experiment. Läkemedel som är dåligt lösliga i vatten kan fällas ut i PSS. Slutligen kumulativ and icke-kumulativa tillsatser av ett läkemedel som är en agonist kan resultera i olika resultat om receptor desensibilisering för agonisten sker; angiotensin II är en sådan drog som visar snabba takyfylaxi.
Fördelar: En av de främsta fördelarna med vävnadsbad experiment är att det är realtid; kan man se experimentet som det utvecklar sig och kan snabbt dra slutsatser och planera nästa steg, samt felsökning under ett experiment. Ett experiment tar en dag att göra. Flera vävnader kan normalt framställas från ett djur så att ett djur kan fungera som sin egen kontroll, och det ger styrka till ett experiment. Man kan även isolera vävnaden från andra faktorer för att testa en relativt ren respons av vävnaden för läkemedlet. In vitro-försök såsom vävnadsbadet systemet medge även användning av en liten mängd av läkemedel jämfört med ett in vivo experiment.
Den grundläggande experimentella designen som beskrivs häri kan varaomfattande modifierats för att möjliggöra registrering av ytterligare parametrar eller införandet av andra yttre stimuli. Till exempel tillägg av elektroder möjliggör elektriskt fält stimulering av innerverar nerver 16,17. Med tillägg av termiska eller pH-givare, kan effekterna av temperatur och pH på kontraktila svaren också mätas 18,19. På samma sätt kan syre ersättas helt eller delvis med N2 för att utvärdera hypoxi inducerade effekter. Dessutom kan samma grundläggande principer om isometrisk kontraktilitet mätning som används i den här videon att användas för att utveckla system som möjliggör samtidig mätning av isometrisk spänning utvecklingen och förändringar i intracellulär kalcium 20. Signaltransduktion är också lätt studeras, eftersom systemen existerar som snabbt kan frysa ett vävnadsprov under ett svar, så att kan verifieras aktiviteten hos en signaltransduktionsväg systemet biokemiskt.
Variationen av ekvipment som kan användas för att göra detta är enorm. Hela detta system, antingen för hand konstruerat eller automatiserad, kan köpas från flera olika företag. Vävnadsbaden och innehavare vävnad som används i detta protokoll var handblåst (vävnads bad) och hand konstruerat (innehavare) genom en intern Michigan State University verkstäder.
The authors have nothing to disclose.
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
Tissue Bath | Multiple Sources | ||
Physiological Salt Solution | PSS | ||
Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
Micrometer | |||
Custom Stands | |||
Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
S-Connector | VWR International | Talon | |
Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
Tissue Dissection | |||
Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |