גישת Bioreporter תא כל להערכת תחבורה וזמינות ביולוגית של מזהמים אורגניים במערכות לא רוויים מים
Summary
Assay bioreporter התא שלם עם sartisoli Burkholderia RP037-mChe פותח כדי לזהות שברים של מזהמים אורגניים (כלומר, fluorene) זמינים לשפלת חיידקים לאחר תחבורה פעילה על ידי mycelia גישור נקבוביות אוויר מלא במערכת מודל בלתי רוויה מים.
Abstract
Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.
Introduction
אדמה מאוכלסת בצפיפות על ידי מגוון רחב של מיקרואורגניזמים 1,2 כגון חיידקים. עם זאת, תנאים בבית גידול זה הם מאתגרים, במיוחד במונחים של מים זמינות 3. חיידקים זקוקים באופן קבוע כדי לחפש תנאים אופטימליים בסביבות הטרוגניות 4, אבל היעדר סרטי מים רציפים וכתוצאה מכך הניידות הוגבלה 5 מעכב אותם כדי להפיץ באופן חופשי. כמו כן, שיעורי דיפוזיה של מומסים (למשל, חומרים מזינים) הם הורידו בתנאים בלתי רוויים 6. לפיכך, חיידקים וחומרים מזינים לעתים קרובות מופרדים פיזי ונגישות תזונתית מוגבלת 3. כתוצאה מכך, וקטור תחבורה לתרכובות כימיות שאינו דורש מים שלב רציף יכול לעזור להתגבר על מגבלות אלה. למעשה, מיקרואורגניזמים רבים כגון פטריות וoomycetes פיתחו צורת צמיחת פילמנטיות מאפשרת להם לגדול דרך נקבובי אוויר מלא ובכך להגיע וmobilizing גם פיזי מופרד חומרים מזינים 7 ו -8 חומרי פחמני על פני מרחקים ארוכים. הם עשויים אפילו לשמש כוקטורי תחבורה ביולוגיים אשר מספקים סוכרים ומקורות אנרגיה אחרים לחיידקי 9. ספיגה והובלה ביצורים mycelial גם הוכחו למזהמים אורגניים הידרופובי כגון פחמימנים ארומטיים polycyclic (PAH) בPythium ultimum 10 או בפטריות mycorrhizal arbuscular 11. מאז PAH הם מזהמי מים נמצאים בכל מקום ומסיסים היטב 12 באדמה, תחבורה בתיווך mycelia עשויה לסייע להגביר את הזמינות הביולוגית מזהם לdegraders חיידקים פוטנציאלי. למרות שהסכום הכולל של מזהם ניתן לכמת באופן ישיר על ידי אמצעים כימיים 10, הזמינות הביולוגית של מזהמים מועברים על ידי mycelia לחיידקי מפרקים ואורגניזמים אחרים לא ניתן להעריך בקלות.
הפרוטוקול הבא מציג שיטה להערכת ההשפעה של myceליה על זמינות ביולוגית מזהם לdegraders חיידקים באופן ישיר; הוא מאפשר איסוף מידע על השפעת spatiotemporal של מזהמים על מערכות אקולוגיות של חיידקים. אנו מתארים כיצד להגדיר את מערכת מיקרוקוסמוס בלתי רוויה משוכללת מחקה ממשקי אוויר-מים בקרקע על ידי קישור מקור נקודת PAH מופרד פיזי עם חיידקי bioreporter PAH-משפיל באמצעות וקטורי תחבורת mycelial. בגלל תחבורה מוטסת מודרה, את ההשפעה של תחבורה מבוססת mycelial על זמינות ביולוגית PAH לחיידקים ניתן ללמוד בדרך מבודדת. בפירוט רב יותר, RP037-mChe sartisoli fluorene שלוש טבעות PAH, האורגניזם mycelial Pythium ultimum וbioreporter חיידק Burkholderia 13 יושמו בsetups מיקרוקוסמוס תאר. B. החיידק sartisoli RP037-mChe נבנה במקור כדי ללמוד והנתיבים phenanthrene לתא 14 ומביע משופר חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) כתוצאה משטף PAH להתא, ואילו fluorescing האדום mCherry בא לידי ביטוי constitutively. מידע מפורט על בניית הכתב ניתן על ידי Tecon et al. 13 בבדיקות ראשוניות, עולה כי אין החיידק שחייה ורק יכולת רץ איטית מאוד. זה היה יכול להעביר לאט בעובש של ultimum Pythium כאשר מיושמים כהשעיה צפופה על גבי העובש. מאז חיידקים היו משובצים בagarose בפרוטוקול הבא, הגירה על העובש לא התרחשה.
באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר (CLSM), ניתן דמיינו חיידקי bioreporter ישירות במיקרוקוסמוס וביטוי של eGFP ניתן לכמת ביחס לכמות תאים (הפרופורציונלית לאות mCherry) בעזרת ImageJ התוכנה. זה מאפשר השוואת זמינות ביולוגית איכותית בתרחישים שונים (כלומר, גבוה או נמוך יותר). שפעת נמצאה זמין ביולוגי לאחר תחבורת mycelial על ידי פ ' ultimum (כלומר, זההיה גבוה יותר מאשר בבקרה שלילית). יתר על כן, הפרוטוקול מתאר כיצד לכמת את הסכום הכולל של תחבורה בתיווך mycelia באמצעים כימיים וכדי לוודא את הזמינות הביולוגית מזהם באמצעות סיבים מצופים סיליקון זכוכית (סיבי SPME) במיקרוקוסמוס הזהה. תוצאות באמצעות התקנת מיקרוקוסמוס זה פורסמו ונדונו לשילוב של פ ultimum, fluorene ו- B. sartisoli 15 RP037-mChe. כאן, במוקד נמצא על תיאור מפורט ושיטת זיהוי בעיות הפוטנציאליות של הפרוטוקול כדי לספק את הידע הזה ליישומים נוספים פוטנציאליים. יישומים נוספים עשויים להיות כרוכים בפטריות שונות, מיני חיידקים (למשל, מאתרים מזוהמים), ומזהמים אחרים (למשל, חומרי הדברה) או זיהום אספקה (למשל, קרקעות בגיל).
Protocol
Representative Results
Discussion
התקנת מיקרוקוסמוס הציגה הוכיחה מתאימה ללמוד את הזמינות הביולוגית של כימיקלים מופרדים מרחבית למשפילה אורגניזמים לאחר הספיגה והובלה בmycelia. תחבורת גז שלב פוטנציאלית של תרכובות נדיפות באופן חלקי מנוע ויכול להיות דמיינו תאי bioreporter חיידקים ללא הכנת מדגם משוכללת ובכך עם ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: | 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest | ||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 | pH 6.0 | ||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2 % | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: | 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8 | ||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: | 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | ||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| imageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland |
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B., et al. . Manual of methods for general bacteriology. 19, 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D., Mukerji, K. G. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Vol. 19, 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
