A Whole Cell Bioreporter Aanpak Verkeer en biologische beschikbaarheid van organische stoffen te evalueren in Water Onverzadigde Systems
Summary
Een hele cel bioreporter test met Burkholderia sartisoli RP037-mChe is ontwikkeld om fracties van een organische verontreiniging (dwz fluoreen-) beschikbaar voor bacteriële degradatie na actief transport door mycelium overbruggen met lucht gevulde poriën in een water onverzadigd modelsysteem detecteren.
Abstract
Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.
Introduction
Grond wordt dichtbevolkt door een groot aantal micro-organismen zoals bacteriën 1,2. Echter, omstandigheden in deze habitat zijn uitdagend, vooral in termen van de beschikbaarheid van water 3. Bacteriën permanent te zoeken naar optimale omstandigheden in heterogene omgevingen 4, maar de afwezigheid van continue water films resulteert in beperkte mobiliteit 5 belemmeren hen om vrij te verspreiden. Ook diffusiesnelheden van opgeloste stoffen (bijv nutriënten) verlaagd onder onverzadigde omstandigheden 6. Aldus bacteriën en voedingsstoffen worden vaak fysiek gescheiden en toegankelijkheid nutriënt beperkt 3. Bijgevolg kan een transport vector chemische verbindingen die een continue waterfase niet vereist helpen om deze beperkingen te overwinnen. In feite hebben vele micro- organismen zoals schimmels en Oomycetes een filamenteuze groeivorm waarmee zij groeien door met lucht gevulde poriën waardoor het bereiken mobi ontwikkeldlizing ook fysiek gescheiden voedingsstoffen 7 en 8 koolstofhoudende stoffen over lange afstanden. Ze kunnen zelfs fungeren als biologische vervoer vectoren die suikers en andere energiebronnen om bacteriën 9 leveren. Opname en transport in mycelium organismen is ook aangetoond voor hydrofobe organische verontreinigingen zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) in Pythium ultimum 10 of arbusculaire mycorrhiza 11. Aangezien PAK zijn alomtegenwoordig en slecht in water oplosbare verontreinigingen 12 in de bodem, zou-mycelium gemedieerd transport helpen om verontreiniging biobeschikbaarheid voor potentiële bacteriële afbrekers verhogen. Dat de totale hoeveelheid verontreinigingen transport direct kunnen worden met chemische middelen 10, biobeschikbaarheid van verontreinigingen met mycelia vervoerd afbrekende bacteriën en andere organismen kunnen niet gemakkelijk worden beoordeeld.
Het volgende protocol toont een werkwijze om de invloed van myce evaluerenlia op verontreiniging biobeschikbaarheid om bacteriële afbrekers op een directe manier; staat het verzamelen van informatie over de spatiotemporele invloed van verontreinigingen op de microbiële ecosystemen. We beschrijven hoe het opzetten van een uitgebreid onverzadigd microkosmos systeem nabootsen van lucht-water-interfaces in de bodem door het koppelen van een fysiek gescheiden PAK puntbron met PAK-afbrekende bioreporter bacteriën via mycelial vervoer vectoren. Omdat de lucht vervoer is uitgesloten, kan het effect van mycelium vervoer op basis van PAK biobeschikbaarheid voor bacteriën worden bestudeerd in een geïsoleerde manier. Meer in detail werden drierings PAK fluoreen, het mycelium organisme Pythium ultimum en bioreporter bacterie Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 toegepast in de beschreven microkosmos setups. De bacterie B. sartisoli RP037-mChe werd oorspronkelijk gebouwd om fenantreen stromen naar de cel 14 bestuderen en tot expressie versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) als gevolg van de PAH fluxde cel, terwijl de rode fluorescerende mCherry constitutief wordt uitgedrukt. Gedetailleerde informatie over de verslaggever bouw wordt gegeven door Tecon et al. 13 In voorproeven, de bacterie bleek geen zwemmen en slechts zeer langzaam zwermen vermogen. Het kon langzaam migreren op hyfen van Pythium ultimum wanneer toegepast als een dichte suspensie bovenop de hyfen. Aangezien bacteriën werden ingebed in agarose in het volgende protocol leverde migratie hyfen optreden.
Met behulp van confocale laser scanning microscopie (CLSM), kan de bioreporter bacteriën direct gevisualiseerd in de microkosmossen en expressie van eGFP kan worden gekwantificeerd in verhouding tot het aantal cellen (evenredig met de mCherry signaal) met behulp van de software ImageJ. Dit maakt vergelijking biobeschikbaarheid kwalitatief verschillende scenario (dwz hoger of lager). FLU werd gevonden biologisch beschikbaar na het mycelium vervoer door P. te zijn ultimum (dat wil zeggen, hethoger dan in een negatieve controle). Bovendien is het protocol wordt beschreven hoe u het totale bedrag van-mycelium gemedieerd transport via chemische middelen te kwantificeren en verontreiniging biologische beschikbaarheid controleren met behulp van silicium gecoate glasvezels (SPME vezels) in identieke microkosmos. Resultaten van deze microcosm ingesteld zijn gepubliceerd en besproken voor de combinatie van P. ultimum, fluoreen en B. sartisoli RP037-mChe 15. Hier ligt de focus op een gedetailleerde beschrijving methode en de identificatie van mogelijke valkuilen van het protocol bij deze kennis bieden voor mogelijke verdere toepassingen. Verdere toepassingen kunnen diverse schimmels, bacteriële soorten (bijvoorbeeld van verontreinigde locaties) te betrekken, en andere verontreinigingen (bijvoorbeeld pesticiden) of verontreiniging-aanbod (bv leeftijd bodems).
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde microkosmos setup geschikt gebleken om de biologische beschikbaarheid van ruimtelijk gescheiden chemicaliën studeren aan een vernederende organismen na opname en transport door mycelium. Potentiële gasfase vervoer van gedeeltelijk vluchtige verbindingen wordt voorkomen en bacteriële bioreporter cellen kunnen worden gevisualiseerd zonder uitgebreide monstervoorbereiding en dus met een minimale verstoring van de gevoelige systeem. Tegelijkertijd, kan chemische analyse van het monster gemakkelijk worde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: | 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest | ||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 | pH 6.0 | ||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2 % | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: | 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8 | ||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: | 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | ||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| imageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland |
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B., et al. . Manual of methods for general bacteriology. 19, 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D., Mukerji, K. G. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Vol. 19, 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
