The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.
The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.
Endotelet är den innersta slemhinnan i kärl och deltar i underhållet av vaskulär homeostas genom reglering av en mängd vasoaktiva processer. Störningar till dessa processer kan predisponera kärlet till ateroskleros och öka risken för hjärt-kärlsjukdom (CVD) 1. Perifer endotelfunktion är en bra indikator på tidiga avvikelser i kärlväggen 2. Vidare har åtgärder av perifer endotelfunktion visats spegla koronar endotelfunktion 3-5, och som sådan betraktas som goda prediktorer för hjärt-kärlsjukdom 6-9. Detta är kanske inte så konstigt med tanke på att åderförkalkning nu i stort sett uppskattas vara en systemisk sjukdom 10. Bedömningar av perifer endotelfunktion kvantifiera typiskt kärlvidgande respons av fartyget till en specifik stimulus, med en dämpning av den förhalningssvar som tyder på endoteldysfunktion 11, och kan mätas på olika kärlbäddar. Bedömningar av avancerade strukturella förändringar i kärlet kan karakteriseras av ultraljudsundersökning av intima-media tjocklek.
I mikrocirkulationen, kan laser Doppler flowmetry (LDF) och Laser Doppler imaging (LDI) med jontofores av vasodilaterande agonister ge användbar information om mikrovaskulär perfusion 12. Båda teknikerna mäter Doppler-förskjutningen som skapas av spritt ljus från att röra röda blodkroppar. Perfusion representeras såsom blod flussmedel i stället för blodflöde (ml / min), med blod flussmedel, vilket är genomsnittlig för röda blodkroppar hastighet och koncentration. Mätning av blod flussmedel linjärt samband med faktiska blodflöde 13. Bedömningen av LDI erbjuder avsevärda fördelar jämfört LDF, eftersom till skillnad från LDF, kan LDI skanna över ett stort område vilket motsvarar heterogenitet i huden blodflödet och öka reproducerbarheten av tekniken12.
Den stimulans för att öka blodflöde under LDI tillhandahålls av jontofores av vasodilaterande agonister acetylkolin (ACh) och natrium (SNP), som bedömer endotel-beroende och endotel-oberoende funktion respektive in i huden med hjälp av en svag elektrisk ström 14. En gång genom huden, ACh binder till endotelceller muskarinreceptorer släppa det kärlvidgande kväveoxid (NO). Användningen av SNP aktiverar direkt glatta muskelcellreceptorer för att möjliggöra maximal vasodilatation av fartyget och granskning av glatt muskulatur integritet 15. Det råder viss osäkerhet om huruvida ACh-medierad dilatation innebär INGEN alls, eftersom ACh kan stimulera icke-NO vägar såsom cykloxygenas medierad vägar 12. Trots detta har vi tidigare rapporterat att ACh och SNP svar nedsatt hos patientpopulationer med ökad risk för hjärtkärlsjukdom 16 och att motion interventioner kända för att förbättra NEJ bioactivity också förbättra ACh-medierad blod flussmedel använder LDI 17. Fordonet för transport agenter i mikrokärl huden innehåller ofta natriumklorid eller avjoniserat vatten 18,19. Mikrovaskulära endotelfunktion kan kvantifieras med hjälp av olika metoder, med kutan vaskulär konduktans – en produkt av flussmedel dividerat med artärtryck, används i studier där blodtrycket kan förändras över studiens längd (dvs, under träning eller antihypertensiv behandling) 12. En annan vanligt förekommande kvantifiering är att beräkna arean under kurvan för blodflöde eller uttrycka den procentuella ökningen av flödet från baslinjen. Det är viktigt att notera att det inte finns några fastställda riktlinjer för att presentera data, men utredarna bör utnyttja en metod som visar god reproducerbarhet.
I de stora fartygen, är flödesmedierad dilatation (FMD) och glyceryl-trinitrat medierad dilatation (GTN) utförs för att bedömas endotel-beroende och endotel-oberoende funktion respektive 20. MKS utförs typiskt i armartären där en manschett används för att ockludera arteriellt blodflöde för 5 min; frisättning av manschetten orsakar en plötslig ökning av blodflödet (reaktiv hyperemi) genom armartären resulterar i skjuvning-stress förmedlad dilatation av fartyget. Baslinjen och efter manschetten frigör diameter kvantifieras genom ultraljud av kärlet med efterföljande bedömningar av kärldiametern manuellt 20 eller använda automatiserade kantdetektering mjukvara 21,22. Användningen av GTN hjälper till att avgöra om avvikelser i vasodilatation beror på en förlust i glatta muskelceller integritet, eller nedsatt frisättning av NO från endotelceller 23. MKS och GTN uttrycks som den procentuella ökningen i post-stimulans kärldiameter i förhållande till baslinjen diameter.
Korrekt bedömning av mul- och klövsjuka kräver ett antalviktiga överväganden i studieprotokollet 24,25. Längden på manschetten ocklusion måste noggrant tidsinställda; 5 min av manschetten ocklusion räcker för NO-medierad dilatation tag manschetten ocklusion ger icke-NO medierad dilatation 26. Likaså, placering av den ockluderande manschetten kring handleden och distalt från ultraljudssonden åberopar övervägande NO-förmedlad dilatation, medan placering av manschetten på överarmen och proximalt till sonden endast delvis stimulerar NO 27. Det är också viktigt att mäta topp dilatation efter manschetten deflation under en längre tidsperiod, eftersom mätning av toppdiametern inom de första 60 sek efter manschetten deflation kan underskattar mul- och klövsjuka 25-40% 28. Faktum är en period av 180 sek sannolikt vara tillräckligt i fånga sann toppdiameter, med de flesta toppvärden som inträffar inom de första 120 sek 28.
Stimulansen för mul- och klövsjuka involverars produktion av skjuvspänning, som aktiverar specifika endotelceller receptorer att frigöra NO 29. Dock kan skjuvspänning även aktivera flera andra vasoaktiva faktorer (varav vissa kan orsaka vasokonstriktion) 30, vilket gör det viktigt att den framkallade skjuvspänningen stimulans speglar vasodilatation från NO vägar 26. Det är också viktigt att ta hänsyn till skjuvspänningen stimulans under FMD, med beräkning av skjuvhastighet (hastighet / diameter) som fungerar som en lämplig åtgärd för skjuvspänning, men inte nödvändigtvis avspeglar PEF 31. Senaste fysiologiska rekommendationer tyder på att skjuvspänningen profilen alltid bör karakteriseras när ultraljudssystem tillåter samtidig mätning av pulsvågshastigheten och aktiv B-mode avbildning i duplexläge 25.
Bedömning av halspulsåder använder B-mode ultraljud kan ge information om carotid intima-media tjocklek (CIMT), och var första described 1986 av pignoli och kollegor 32. Bedömning av CIMT reflekterar proliferation av glatta muskelceller in i intiman av kärlet och är en användbar prediktor av kliniska händelser i tidig ateroskleros 33. Carotid ultraljud kan ofta förutse arteriell struktur bättre än liknande tekniker (såsom magnetisk resonanstomografi eller röntgen bedömningar) 34. Dessutom CIMT associerar med ett antal klassiska CVD riskfaktorer, inklusive åldrande, hypertension och dyslipidemi 35. Ändringar väggarna i karotidartären vanligtvis initieras av en minskning av NO-biotillgänglighet som främjar inflammation inuti kärlet 36. De gemensamma halspulsådern, carotis interna och hals bifurkation poäng kan användas för att bestämma CIMT, eftersom varje plats kan på liknande sätt förutsäga kardiovaskulära händelser 37.
I föreliggande manuskriptet ger vi detaljerad metod för bedömning av microvascular endotelfunktion (LDI med jontofores), stort fartyg endotelfunktion (FMD och GTN) och kärl morfologi (CIMT). Ateroskleros är en flerstegsprocess som börjar med endoteldysfunktion och slutar med fokala aterosklerotiska lesioner i de stora artärerna. Den logiska grunden för valet av ovanstående bedömningar är att de speglar de olika stadierna av ateroskleros och hjälper till att redogöra för den heterogena karaktären hos kärl 38. Dessutom har vi tidigare visat att i en population av patienter med ökad risk för CVD, mikrovaskulära endotelfunktion var oberoende från stora kärl endotelfunktion 39, och funktionella bedömningar var oberoende av strukturella bedömningar av kärl 40. Därför kan de globala bedömningar av kärl hjälpa till att dechiffrera de olika stadierna av ateroskleros.
Den nuvarande manuskriptet detaljer metodiken av flera olika bedömningar av vaskulär funktion och morfologi som kan utföras i det perifera kärlsystemet. Varje bedömning ger information om de olika stadierna av ateroskleros, och bidra till att karakterisera den vaskulära profilen olika kärl territorier.
Vi har tidigare rapporterat att mikrovaskulära endotelfunktion är oberoende från stora kärl endotelfunktion i en population av patienter med reumatoid artrit med ökad risk för hjärtkärlsjukdom 39. Dessutom bedömningar av vaskulär funktion och morfologi var också oberoende av varandra i samma grupp av patienter och hos patienter med CVD 40,41. Dessa resultat kan förklaras av heterogenitet funktion och struktur av endotelceller i olika kärl territorier 38, samt en möjlig eftersläpning för progression av funktionella förändringar morfologiskAvvikelser i kärlet. En studie av Hashimoto och kollegor 42 visade att flera deltagare med åderförkalkning hade minskat värden FMD men normal CIMT värden. Dessa fynd tyder på att granskningen av subklinisk ateroskleros med hjälp av olika metoder är viktigt att dechiffrera de globala effekterna av CVD.
Vikten av mikrovaskulaturen vid hälsa och sjukdom får allt större uppmärksamhet i den medicinska litteraturen. De mikrokärl bildar en mycket större yta än stora fartyg gör dem viktiga mål för skador från skadlig stimuli 43. Det har antagits att mikrokärl kan vara den primära källan av inflammatoriska mediatorer som infiltrerar endotelet av de större fartygen som leder till lesionsbildning 43. I typ II diabetiker, föregår mikrovaskulära sjukdomar ofta stort kärl sjukdom 44, och i andra populationer med ökad risk för hjärtkärlsjukdom såsom reumatoid arthritis, interventioner som minskar CVD risken förbättra mikrovaskulära, men inte stort kärl, endotelfunktion 45,46. Tillsammans står dessa fynd tyder på att undersökning av mikrovaskulär funktion kan hjälpa till att förstå de komplexa mekanismer som initierar ateroskleros.
I föreliggande arbete, var bedömningen av mikrovaskulära endotelfunktion utförs med hjälp LDI med jontofores av vasoaktiva läkemedel. Flera andra bedömningar kan användas för att bedöma mikrovaskulära funktion inklusive nailfold capillaroscopy och venös ocklusion pletysmografi. Dock ger den tidigare bedömningen information om endast mikrovaskulära morfologi, medan den senare är tidskrävande och i vissa protokoll invasiva pga administration av intra-brachialis vasoaktiva ämnen 1. Däremot erbjuder LDI en enkel, tidseffektiv metod för att mäta mikrovaskulär perfusion fartyg hud blod som svar på vasoaktiva medel som administreras icke-invastivt. Mätningen av hudens blodflöde har vunnit bred acceptans i litteraturen på grund av dess lättillgänglighet och stark korrelation med etablerad CVD 12. Dessutom fördelen av LDI framför andra Doppler tekniker såsom laser Doppler flowmetry, är att den samtidigt kan skanna flera punkter i ett visst område och kan därför stå för cellulära rörelse artefakter och rumsliga skillnader i hudens blodflöde, som båda kan påverka perfusion av kärlet 47,48.
Trots de uppenbara fördelarna med jontofores är det viktigt att notera att strömmen inducerad vasodilatation (CIV) från jontofores värde kan påverka effekterna av vasoaktiva medel särskilt vid katoden. Valet av fordon för läkemedelstillförsel skulle kunna bidra till att minska denna effekt, med 0,5% natriumklorid (som används i det nuvarande protokollet) effektiva för att begränsa CIV 18. Dessutom använder av kammare med större diameter och låg elektrisk byrackahyror (som används i det nuvarande protokollet) alla bidra till att minska CIV 18. Användning av en kontrollstället har också rekommenderat 12. Biologiska och beteendemässiga faktorer kan också påverka tillförlitlighet och repeterbarhet av tekniken. Till exempel har dygnsrytm variation och rökning visats påverka mikrovaskulär endotelfunktion 49,50. Strikta inspelningsförhållanden måste följas för att få korrekta resultat och fastställda riktlinjer bör följas vid utformning av protokoll 12.
Mätning av MKS och GTN-medierad dilatation ger information om endoteldysfunktion i de stora blodkärlen, och används i stor utsträckning i icke-invasiv kärlforskning. Mul- och klövsjuke Tekniken ger surrogat information om NO biotillgänglighet och är en användbar prognostisk markör för hjärthändelser i olika kliniska populationer 7-9. I föreliggande arbete, presenterade protokollet står för många av de faktorer somär nödvändiga för adekvat stimulering av NO-medierad vasodilatation 25. Till exempel var blockeringen manschetten placeras distalt till ultraljudssonden och runt handleden 27, hur länge ischemi var 5 min 26 och tillräcklig tid fick spela den "sanna" peak diameter efter reaktiv hyperemi 28. Tyvärr har protokollet inte omfatta karakteriseringen av skjuvspänningen profil som den automatiska kantdetektering programvara inte tillät samtidig inspelning av kärldiameter och pulsvågshastigheten signal. Beräkningen av skjuvspänningen är integrerad med noggrann mätning av mul- och klövsjuka 26 och vi rekommenderar att om möjligt vaskulära forskargrupper använda programvara som tillåter sådana mätningar som ska utföras.
Bedömningar av mul- och klövsjuka och GTN-medierad dilatation är också känsliga för miljö- och biologiska variationer 24, som små förändringar i kärldiameter kanframkalla stora FMD / GTN svar. Till exempel, typiska värden MKS för friska deltagare varierar från 5-10% 51, vilket motsvarar en 0,25 – 0,5 mm förändring i arteriellt diameter för en artär med en diameter av 5 mm. Givet sådana små förändringar i artärdiameter, måste noggrann uppmärksamhet ägnas åt tekniska och biologiska faktorer som kan påverka mätningen. I själva verket kan MKS påverkas av en mängd olika biologiska och beteendemässiga faktorer såsom sympatisk aktivering 52, sömnbrist 53, caffeineförbrukning 54, rökning 55, antioxidantterapi 56 och tid på dagen 57. Därför är det viktigt att kontrollera för dessa faktorer genom att utnyttja information från fastställda riktlinjer 24,25.
Bedömning av avancerade men subklinisk ateroskleros gjordes med hjälp CIMT. Tekniken har använts i flera kliniska populationer och ger mycket detalj på arteriell structure jämfört med mer sofistikerade metoder, såsom magnetisk resonanstomografi 34. Som med de andra vaskulära tekniker, mätning av CIMT kräver noggrant övervägande av tekniska faktorer som kan påverka mätningen. Generellt bör CIMT utföras i områden som är fria från plack, i den bortre väggen av den gemensamma halsartären. Liknar MKS, mätning av CIMT utförs med hjälp högupplösta ultraljud och så är mycket användarvänlig beroende. Rapporterad variationskoefficienten (CofV) intervall 2,4-18,3% 58, medan för FMD den är 1-84% 59. Men även då båda teknikerna utförs av behöriga ultrasonographers med externa faktorer välkontrollerade, finns det fortfarande en hög CofV 58,60,61. En orsak till detta kan vara att analysera kärl gränser utförs med manuella metoder 60,61. Sådan analys kan minska tillförlitlig som avbildningsartefakter såsom falska gränser, buller från ultrasound signal, och snedvridning av fartyg kan påverka tolkningen av bilden 22.
Den senaste utvecklingen i kontinuerlig automatiserad kantdetektering programvara har förbättrats avsevärt detektion av kärlväggsgränser 21,22. I föreliggande studie var via programvara som används för att mäta armartären diametern, medan AMS användes för att detektera CIMT. Användningen av dessa program minskar kraftigt operatörsberoende, men i fallet med AMS, är en viss grad av operatörskontroll fortfarande tillgänglig i situationer där bildkvaliteten kan vara dålig 62. Laboratorier som använder automatiserade kantdetektering programvara i allmänhet tenderar att ha låg CofV 58,63,64, så det borde vara målet för alla kärlforskningslaboratorier att införliva automatiserad mätning av kärl gränser för att säkerställa riktigheten av resultaten. Det är också bra att rapportera resultaten av reproducerbarhet studier för specifika protokoll vid publicering studieresultat.
<p class = "jove_content"> Även bedömningar av kärlfunktionen används rutinmässigt i klinisk forskning, är en begränsning av de tekniker som normativa värden för LDI med jontofores och FMD inte existerar. Det är därför viktigt att friska ålders- och könsmatchade kontrollgrupper undersöks jämföra fynd med experimentgruppen. Även om dessa tekniker förknippar med dålig prognos i en mängd olika populationer med bevis för CVD 6-9, finns det fortfarande en brist på studier som har undersökt sambandet mellan fattiga endotelfunktion och negativa kardiovaskulära utfall såsom hjärtinfarkt och stroke. Ytterligare prospektiva studier krävs för att lösa dessa problem. En annan begränsning är att använda mänskliga operatörer att utföra bedömningar och utföra analysen. Detta inför en potentiell källa till partiskhet; Emellertid kan detta vara begränsat genom bländande operatören att resultaten eller säkerställa att läsaren är annorlunda från operatören. Detär också viktigt att säkerställa att läsaren följer ett standardiserat protokoll för analys av data, så att all data konsekvent analyseras.Sammanfattningsvis ger föreliggande manuskriptet detaljerad information om de metodologiska åtgärder som krävs för att framgångsrikt utföra bedömningar av mikrokärls och stort fartyg endotelfunktion samt kärl morfologi perifera cirkulationen. När de används tillsammans, bedömningarna ge global information om de olika stadierna av ateroskleros. Ytterligare prospektiva studier som undersökt potentialen diagnostiska roll dessa tekniker är motiverade.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr George Balanos for his assistance in the flow-mediated dilatation technique.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Laser Doppler Imager | Moor Instruments, Devon, UK | moorLDI2 | |
Iontophoresis Controller | Moor Instruments, Devon, UK | MIC2 | |
Miochol-E 20mg | Novartis UK | Prescribed by physician | Acetylcholine for endothelium-dependent function |
Nitroprussiat Fides 50mg | Rottapharm Spain | Prescribed by physician | Sodium nitroprusside for endothelium-independent function |
Doppler Ultrasound | Siemens PLC, Camberley UK | Accuson Antares | |
Glyceryl Trinitrate 500 mcg | Alpharma, Barnstaple, UK | Prescribed by physician |