Method Article

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

DOI:

10.3791/52347

⸱

December 27th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lökositlerin bir alt tipi ve makrofajların öncüleri olan monositler, organizmaların birçok önemli sürecinde yer alır ve genellikle biyomedikal biliminde çeşitli alanların konusudur. Aşağıda açıklanan yöntem, murin monositlerini heterojen kemik iliğinden izole etmenin basit ve etkili bir yoludur.

Balb/c farelerinin femur ve tibiasından alınan kemik iliği, fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanarak toplanır. Hücre süspansiyonu, makrofaj-koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenir ve monositlerin adezyon ile tetiklenen farklılaşmasını önlemek için ultra düşük bağlanma yüzeylerinde kültürlenir. Monositlerin özellikleri ve farklılaşması çeşitli aralıklarla karakterize edilir. Fenotipleme için CD11b, CD115 ve F4/80 gibi belirteçlere sahip floresan ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması (FACS) kullanılır. Yetiştiriciliğin sonunda, süspansiyon% 45±% 12 monositlerden oluşur. Yapışkan makrofajları uzaklaştırarak saflık %86'ya± %6'ya kadar yükseltilebilir. İzolasyondan sonra monositler çeşitli şekillerde kullanılabilir ve in vivo doğum için en etkili ve yaygın yöntemlerden biri intravenöz kuyruk ven enjeksiyonudur.

Bu izolasyon ve uygulama tekniği, özellikle inflamasyon veya immünoloji alanlarında fare modeli çalışmaları için önemlidir. Monositler ayrıca fare hastalığı modellerinde terapötik olarak da kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monositlerin izolasyonu, birçok in vitro ve in vivo çalışma için önemli ve kritiktir. Bu hücreler, periferik arter hastalığı, koroner kalp hastalığı veya diğer iskemik hastalıklar gibi hastalıklar için hedeflerdir, çünkü kollateral damar büyümesi güçlü bir şekilde lokal inflamasyon tarafından yönlendirilir. Enflamatuar yanıtlar, endotelyal aktivasyonu ve lökositlerin, esas olarak monositlerin lokal alımını içerir, bunlar daha sonra makrofajlara olgunlaşır ve bir arteriolün fonksiyonel bir kollateral arter1-3'e yeniden şekillenmesini indüklemek için çoklu büyüme faktörleri salgılayarak oldukça arteriyojenik bir ortam oluşturur. Monositler a....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada hayvansal koruma (24D-9168,11-1 / 2008-24) Alman Yasanın 8. göre, Saksonya ve Saksonya Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle Devlet izni ile yapıldı.

1 Hücre İzolasyonu

Femur ve Tibia 1.1 Hazırlık

  1. Kapalı bin izofluran vaporizing bir% 5 izofluran konsantrasyonu kullanılarak fare anestezisi. Fare 3 saniye hareket durduktan sonra, servikal dislokasyon gerçekleştirin.
  2. Etanol (% 96) ile arka bacaklarda dezenfekte. Cilt ve kasları çıkarın ve steril bir bisturi ile kemikleri ayırın.
    1. Inguinal cilt kesi ile başlayın, ve medial malleol doğru kesi uzatmak ve alt baldır çevre....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fare kemik iliğinden elde edilen hücre çözeltisi çeşitli hücre tiplerinin oluşur. ana hücre tipi lenfositler, granülositler ve monositlerdir. Hücre tipi farklılaşma 5 gün sonra hasat hem doğal süspansiyonlar ve hücreler için Şekil 1 'de gösterilen boyutta ve ayrıntı ile tahmin edilebilir. Yetiştirilmesi sırasında değişen hücresel bileşim edin. Ancak, nüfusun doğru sınıflandırma hücresel belirteçlerin ayırt edici ifadesi güvenmek gerekir.

MPS-Sisteminin hücreleri tanımlamak i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliğinden sıçangil monosit büyük miktarda izole etmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem tarif eder. Monosit verimleri 5 x10 6 1.4 elde periferik kan kullanan diğer protokoller ile karşılaştırıldığında, biz tek bir donör fare 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monositlerin yüksek verim elde edebiliyoruz.

Bu yöntemle zorlukları göz önüne alındığında, bu steril olmayan koşullarda çalışırken kontaminasyon potansiyeli söz önemlidir. Durulama ve sonraki yık.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Alman Araştırma Vakfı) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, işbirlikçi araştırma merkezi) tarafından desteklenmiştir.

Teknik destek için Otto-von-Guericke Üniversitesi Magdeburg, Magdeburg, Almanya'dan Audiovisuelles Medienzentrum'dan Hans-Holger Gärtner'e teşekkürler.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6 kuyulu ultra düşük bağlantı plakasıCorning Incorporated, NY, ABD6 kuyulu ultra düşük bağlantı plakası, kapaklı, steril
8-12 haftalık, erkek, balb/c fareler Charles Nehri, Sulzfeld, Almanya
96 kuyulu plakaGreiner bio one GmbH, Frickenhausen, Almanya
Mavi ölü hücre lekesiLife technologies GmbH, Darmstadt, Almanya
Sığır serum albüminiGE Healthcare, Freiburg, AlmanyaFraksiyon V, pH 7.0
KanüllerB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Almanya28G, 30G
CD115eBioscience, San Diego, ABD12-1152
CD11beBioscience, San Diego, ABD53-0112
Hücre kültürü kabıGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, AlmanyaKapaklı, steril
SantrifüjBeckman Coulter GmbH, Krefeld, AlmanyaAllegra® X-15R santrifüj
Tüy dökücü kremVeet, Mannheim, Almanya
Dezenfeksiyon maddesiSchü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, AlmanyaKodan Tinktur forte
Tek kullanımlık neşter No.10 Tüy emniyetli tıraş bıçağı Co.Ltd, Osaka, Japonya 
EDTASigma Aldrich, Hamburg, Almanya
Etanol %96 Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Almanya
Ekstraksiyon ünitesi PipetusHirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Almanya
F4/80AbD Serotec, Dü sseldorf, AlmanyaMCA497APC
FACS tamponu Tek bileşenligrubumuz tarafından üretilmiştir PBS, %0.5 BSA, %0.1 NaN3
FACS cihazıBecton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, ABDBD FACS Canto II
FACS tüpleri       Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, ABD
Falcon® pipetBecton Dickenson Labware, NY, ABD
Fetal buzağı serumuSigma Aldrich, Hamburg, Almanya
İnce forsepsRubis, Stabio, İsviçre
EldivenRö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Almanya
Gr1eBioscience, San Diego, ABD53-5931
Isıtma plakası Labotect GmbH, Gö ttingen, Almanya Hot Plate 062
İnkübatörEwald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, AlmanyaIncu safe
IsofluranBaxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Almanya
Işık mikroskobuCarl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, AlmanyaAxiovert 40 ° C
Makrofaj-Koloni Uyarıcı FaktörSigma Aldrich, Hamburg, AlmanyaSRP3110 
Mekanik çalkalayıcıIKA, Staufen, Almanyams2 minishaker
Orta 199PAA Laboratories GmbH, Pasching, Avusturya37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Mikro test tüpleriEppendorf AG, Hamburg, Almanya
Mikrobiyolojik çalışma tezgahıThermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, AlmanyaHera güvenli
Monosit yıkama tamponu Grubumuz tarafından tek bileşenliPBS, %0,5 BSA, 2 mM EDTA
Fare tutucuÇeşitli
NaClBerlin Chemie AG, Berlin, Almanya
NaN3 (sodyum asit)Sigma Aldrich, Hamburg, Almanya
Neubauer sayma odasıPaul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Almanya
Naylon hücrelerBecton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, ABDHücre süzgeci, 70 & m ağ boyutu
Penisilin/StreptomisinSigma Aldrich, Hamburg, Almanya
Fosfat tamponlu salinLife technologies GmbH, Darmstadt, AlmanyapH 7.4, steril
PipetlerEppendorf AG, Hamburg, Almanya10&mikro; L / 100 ve mikro; L / 200 ve mikro; L / 1.000 ve mikro; l
Pipetleme kafalarıEppendorf AG, Hamburg, Almanya
Serolojik pipetGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, AlmanyaCellstar 5 ml, 10 ml
Aspirasyon ünitesiIntegra bioscience, Fernwald, AlmanyaVacusafe konfor
Cerrahi makasWord Precision Instruments, Inc., Sarasota, ABD
ŞırıngaB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Almanya1 ml Omnifix® -F insülin şırınga
Kapaklı tüplerGreiner bio one GmbH, Frickenhausen, Almanya15 ml/50 ml Cellstar tüpleri
Sıcak su banyosuJulabo Labortechnik GmbH, Seelbach, AlmanyaJulabo SW22

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
  2. Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow MonocytesMonocyte IsolationFlow CytometryIntravenous InjectionUltra Low AttachmentM CSF TreatmentCD11b CD115 F4 80Tail Vein InjectionMonocyte PurityBone Marrow Harvesting

Related Articles