Metoder för biopsi av vastus later, beredning av renat mitokondrier, och respirometric profilering beskrivs. Användningen av små muskelvolym gör denna teknik som lämpar sig för kliniska forskningsansökningar.
Respirometric profilering av isolerade mitokondrier används ofta för att undersöka elektron transportkedjan funktion. Vi beskriver en metod för att erhålla prover av humana vastus later, isolera mitokondrier från minimala mängder skelettmuskelvävnaden, och platta baserad respirometric profilering använder ett extracellulärt flöde (XF) analysator. Jämförelse av respirometric profiler framställts på 1,0, 2,5 och 5,0 pg av mitokondrier visar att 1,0 mikrogram är tillräcklig för att mäta andning och att 5,0 mikrogram ger mest konsekventa resultat baserat på jämförelse av standardfel. Western blot-analys av isolerade mitokondrier för mitokondriell markör COX IV och icke-mitokondriell vävnadsmarkör GAPDH indikerar att det finns begränsad icke-mitokondriell kontamination användning av detta protokoll. Möjligheten att studera mitokondriella respiration i så lite som 20 mg muskelvävnad tillåter användare att utnyttja enskilda biopsier för flera studie endpoints i kliniskforskningsprojekt.
Mitokondrier är de primära energi produktionsanläggningar i cellen och har viktiga roller i åldrandet samt olika åldersrelaterade sjukdomar såsom hjärt- och kärlsjukdomar, Alzheimers sjukdom, diabetes, cancer och fetma. Respirometric profilering av isolerade mitokondrier ger direkt analys av elektrontransportkedja (ETC) funktion och har bidragit avsevärt till vår förståelse av mitokondrie biologi och dess roll i hälsa och sjukdom. Isolerade mitokondrier används för att studera olika aspekter av bioenergetik gillar, substrattransport, ATP-syntas aktivitet, proton läcka, etc. Den metod som beskrivs i detta manuskript har optimerats för att tillåta respirometric analys av mitokondrier isolerade från skelettmuskel vävnadsbiopsier erhållits från människa. Den biopsi protokoll som beskrivs i detta manuskript har använts av vår personal under de senaste 12 åren. Vår grupp har utfört över 700 förfaranden för vuxna i olika åldrar,upp till 90 år gamla, och med olika kroniska sjukdomstillstånd utan några negativa säkerhetsfrågor. En viktig aspekt av detta protokoll är att den är speciellt utformad för att använda minimala mängder vävnad, vilket underlättar dess användning i kliniska forskningsstudier.
Olika protokoll har utvecklats för att isolera mitokondrier. Fernandez-Vizarra et al., 1,2 beskrivit ett förfarande för isolering av mitokondrier från olika råttvävnader såväl som odlade celler. Al. Garcia-Cazarin et 3 har rapporterat en metod för att isolera mitokondrier från skelettmuskler från råtta och mus. En metod för isolering av mitokondrier från råtthjärna har också rapporterats av Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. 5 rapporterade ett förfarande för isolering mitokondrier med hjälp av barocycler och / eller PCT dokumentförstörare. Nyligen, al. Franko et 6 rapporterade en metod för att isolera höganrikat mitokondrier använder anti-TOM22 Magnetiska pärlor.
Medan dessa protokoll ge utmärkta resultat, vävnadsstorlekskrav är höga jämfört med den metod som beskrivs i detta manuskript. Till exempel använde al. Gross et 5 1,5-1,8 g av gastrocnemiusmuskeln, och ca 2 g av njurvävnaden. Likaså al. Franco et 6 använde 500 mg muslevervävnad. Från vår erfarenhet, att typiska avkastning kan förväntas av perkutan nål biopsi av skelettmuskel (vastus later) varierar från 100-200 mg. Förmågan att bedöma mitokondriefunktion i 20-50 mg av muskelvävnad med hjälp av protokoll som beskrivs här tillåter användarna att utföra flera bedömningar per biopsi och att lagra prover för framtida användning i andra molekylärbiologiska experiment. Detta är ett kritiskt inslag i klinisk forskning och andra studier som kräver flitig användning av prover. Det bör noteras att tidigare frysta mitokondrierna är inte bra för att studera kopplade andning på grund av outer mitokondriell membranskada och förlust av cytokrom C-aktivitet. Vår metod har anpassats och modifierats metoden publiceras av Chappell och Perry 7.
Använda de metoder som beskrivs i detta manuskript, har vi nyligen rapporterat att respirometric profil mitokondrier isolerade från human Vastus later är direkt korrelerad med fysisk förmåga, mätt som gånghastighet 8.
Isolerade mitokondrier används ofta i studier som undersöker den roll som ETC funktion, liksom andra mitokondriella aktiviteter, inklusive underbyggnads transporter och TCA cykeln funktion. Respirometric analyser som använder isolerade organ medger direkt undersökning av grundläggande processer av oxidativ fosforylering och inneboende egenskaper ETC. Respirometric profilering av isolerade mitokondrier i jämförelse med hela celler eller permeabilized muskelfibrer har fördelarna med relativt lätt tolkning av data och frånvaron av "störning" från icke-mitokondriella processer eller förändringar i mitokondriernas massa / biogenesis. Normalisering av data baseras på mitokondriell proteinhalt, vilket möjliggör enkel kors jämförelse av mitokondrier mellan prover. Respirometric profilering av isolerade mitokondrier är en föredragen metod när syftet med studien är att fastställa underliggande mekanismer och identifiera specifika mål såsom ETC komponents / komplex, eller mitokondriella transportmekanismer.
Beskrivs är ett protokoll för muskelbiopsi och isolering av funktionella mitokondrier från små vävnadsprover. Denna metod ger reproducerbara resultat mellan användare på grund av utnyttjande av en automatiserad sator kontra handdriven dounce homogenizers. Isolering av mitokondrier kan utföras med så lite som 20 mg av muskelvävnad. Mängden isolerade mitokondrier som kan erhållas från denna urvalsstorleken är tillräcklig för att köra Seahorse plattbaserad respiration medan överskotts mitokondrier för andra experiment och lagring för ytterligare molekylära analyser. Det kan noteras att denna metod kan översättas till XF 96, där även mindre mängder mitokondrier kan användas (1-2 ug per brunn).
Flera protokoll för isolering mitokondrier beroende dounce homogenizers för vävnadsstörningar initialt. En nackdel med denna metod är de praktiska naturen av den ursprungliga vävnadenhomogenisering. Kraften och hastigheten på mortelstöt i homogeniseringsanordningen kan variera kraftigt mellan operatörer 6. Detta kan resultera i experiment-till-experimentet variation, liksom labb-till-lab variation, och leder till svårigheter att jämföra data mellan experiment. Detta är särskilt oroande i humana interventionsstudier när data från deltagarna samlas vid skilda tidpunkter, vanligtvis före och efter behandlingen, och kan utsättas för flera webbplatser. Vi använder en automatiserad sator för en mer enhetlig metod som ger mer reproducerbara resultat med begränsad person-till-person-variation. Hastigheten för beredningen gör också detta tillvägagångssätt lämpar sig för hantering av flera prover samtidigt. Typiskt kan upp till tre experiment utföras på en enda dag.
Potentiella begränsningar av den teknik som beskrivs här uppstår genom användning av isolerade organeller och användning av en platta-baserat format. Exempelvis Picard et al. har demonstrated att isolerade mitokondrier har funktionella egenskaper som skiljer sig väsentligt från dem som av intakta mitokondrier i permeabilized myofibers. De föreslog att mitokondriella isoleringstekniker leder till förändrad bioenergetisk funktion, såsom signifikant ökad RCR jämfört med permeabilized myofibers åtföljs av större reaktiva syreradikaler produktion 13. Jämfört med permeabilized muskelfibrer, isolering av mitokondrier kräver längre förberedelsetid. Också, förlust av cellulära halten minskar fysiologiska relevansen, något som kvarhålles i hela celler och till och med permeabiliserade fibrer. Användningen av plattbaserad respiration med de beskrivna tillstånden teknik replikera körningar per prov. Emellertid måste mitokondrier vidhäfta till botten av varje brunn. Denna konfiguration skiljer sig från deras normala miljö och kan påverka funktionella egenskaper. Dessutom bör det noteras att användning av detta protokoll för mitokondriell isolering, there kan fortfarande vara kontamination från endoplasmatiska retiklet (ER) i mitokondriella förberedelser. Skillnader i kontamination ER kan påverka bestämningen av mitokondriella avkastning och påverka resultatet.
Sammanfattningsvis visar denna studie data som bekräftar att mitokondrier isolerade från vävnader med hjälp av detta förfarande är funktionellt aktiva och kan användas för studier / applikationer som kräver hög kvalitet isolerade mitokondrier från minimal mängd av skelettmuskelprover. Fördelen med denna metod är att: i) Det är möjligt att isolera mitokondrier från minimala mängder skelettmuskulaturen, ii) förfarandet är snabbt, iii) med plattan baserad teknik är det möjligt att köra flera prover samtidigt, och iv) det finns tillräckligt med överskott vävnad och isolerade mitokondrier efter bioenergetiska analysen för provförvaring och andra molekylärbiologiska undersökningar.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.
Equipment | ||
Name of the Equipment | Company | |
Homogenizer Bio-Gen PRO200 | BioExpress | |
Eppendorf Centrifuge 5804 R | Fisher Scientific | |
Deepwell late Rotor | Fisher Scientific | |
6mm University College Hospital Needle | Cadence | |
60cc syringe | Fisher Scientific | |
96-well plate reader | Tecan (Genios-basic) | |
Seahorse XF 24-3 analyzer | Seahorse Biosciences, Inc. | |
Protein gel system | Life Technologies (Invitrogen) | |
Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | |
Kodak camera assembly | Carestream Health, Inc | |
Consumables | ||
Name | Company | Catalog Number |
XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 100850-001 |
100867-100 | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 |
Hydrochloric acid (HCl) | Acros | 12421-0010 |
Dulbecco's Phosphate buffered saline | Lonza | 17-512F |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P333 |
MOPS | Fisher Scientific | BP308 |
EDTA | Fisher Scientific | BP118 |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 |
ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 |
Fatty acid-free BSA | Calbiochem | 126575 |
Sucrose | Sigma-Aldrich Co | S0389 |
Bacterial proteinase | Sigma-Aldrich Co | P-8038 |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 |
EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 |
BCA protein assay kit | Sigma-Aldrich Co | PI23227 |
Succinic Acid* | Sigma-Aldrich Co | S3674 |
Pyruvic acid* | Sigma-Aldrich Co | P5280 |
Malic acid* | Sigma-Aldrich Co | 2288 |
ADP(K+ salt)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 |
XF Cell mito stress test kit | Seahorse Biosciences | 101706 |
Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 |
NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX |
Immobilin Transfer Membranes (0.45um) | Millipore | IPVH20200 |
MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 |
NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 |
Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) | Abcam | ab14734 |
Primary antibodies (mAB to GAPDH) | Abcam | ab9484 |
Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF822E001EA |
Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF812E001EA |
*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only |