En strømlinet tilgang til screening for ekspression af rekombinante membranproteiner i Escherichia coli baseret på fusion til grønt fluorescerende protein præsenteres.
Produktionen af rekombinante membranproteiner til strukturelle og funktionelle undersøgelser er stadig teknisk udfordrende på grund af lave niveauer af udtryk og den iboende ustabilitet i mange membranproteiner engang opløst i vaske- og rengøringsmidler. En protokol er beskrevet, der kombinerer ligering uafhængig kloning af membranproteiner som GFP-fusioner med ekspression i Escherichia coli påvist ved GFP-fluorescens. Dette gør det muligt konstruktion og udtryk screening af membranprotein flere / varianter at identificere kandidater, der er egnede til yderligere investering af tid og kræfter. GFP reporter anvendes i en primær screening af ekspression ved at visualisere GFP-fluorescens efter SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Membranproteiner, der viser både et højt ekspressionsniveau med minimum nedbrydning som angivet ved fraværet af frit GFP, er udvalgt til en sekundær skærm. Disse konstruktioner er skaleret og en fraktion total membran fremstillet og solubilisered i fire forskellige rengøringsmidler. Efter ultracentrifugering for at fjerne detergent-uopløseligt materiale, der lysater analyseredes ved fluorescens detektion gelpermeationskromatografi (FSEC). Overvågning af størrelsen udelukkelse profil ved GFP-fluorescens giver oplysninger om mono-dispersitet og integriteten af de membranproteiner i forskellige rengøringsmidler. Protein: vaskemiddel kombinationer, elueres med en symmetrisk top med ringe eller ingen gratis GFP og minimum sammenlægning er kandidater til efterfølgende rensning. Ved hjælp af denne metode, den heterolog ekspression i E. coli af SED (form, forlængelse, division, og sporulation) proteiner fra 47 forskellige arter af bakterier blev analyseret. Disse proteiner har typisk ti transmembrandomæner og er afgørende for celledeling. Resultaterne viser, at produktionen af SEDS orthologer i E. coli var meget variable med hensyn til ekspressionsniveauer og integriteten af de GFP fusionsproteiner. Forsøget identified en delmængde for yderligere undersøgelser.
Det er blevet anslået, at membranproteiner udgør ca. 20-30% af generne kodet i alle sekventerede genomer 1, herunder det humane genom 2. I betragtning af deres afgørende rolle i mange biologiske processer, fx transport af metabolitter, energiproduktion og som lægemiddelvirkninger, der er intens interesse i fastlæggelsen af deres tredimensionelle struktur. Men i forhold til opløselige proteiner, membranproteiner er meget underrepræsenteret i Protein Data Bank. Faktisk de 99.624 frigivne strukturer i FBF ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) kun 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ), klassificeres som membranproteiner. Dette afspejler de tekniske vanskeligheder ved at arbejde med membranproteiner, der er naturligt til udtryk på et relativt lavt niveau; rhodopsin er en af de få undtagelser 3,4. Over-ekspression af rekombinant udgaves i heterologe celler resulterer ofte i misfoldning og dårlig målretning til membranen, hvilket begrænser den samlede produktion. At vælge det bedste vaskemiddel til ekstraktion og opløsning af et membranprotein engang udtrykte gør efterfølgende rensning vanskelig og kræver omhyggelig optimering.
Escherichia coli er det mest almindeligt anvendte ekspressionsvært til membranproteiner tegner sig for 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) strukturer løst til dato er næsten udelukkende fra bakterielle kilder. Specifikke E. coli stammer, C41 (DE3) og C43 (DE3), er blevet isoleret, som ikke fører til overekspression af membranproteiner og dermed undgå virkningerne af toksicitet observeret for andre BL21 stammer 5,6. Tuning niveauet af rekombinant membran proteinekspression synes at være kritisk for at optimere produktionsniveauet 6,7.
<p class="Jove_content"> I mange tilfælde lykkes produktion af membranproteiner til strukturbestemmelse har krævet evalueringen af flere versioner, herunder amino- og carboxyterminale deletioner, flere orthologer at udnytte naturlig sekvens variation og forskellige fusionsproteiner 6-8. Derfor er det nødvendigt med en fremgangsmåde til ekspression screening af flere membranproteiner i parallel. En almindeligt anvendt fremgangsmåde er at fusionere proteinet til grønt fluorescerende protein (GFP), som muliggør ekspression skal spores uden behov for at oprense proteinet. På denne måde kan information om ekspressionsniveau, stabilitet og opførsel i forskellige detergenter vurderes med små mængder af un-oprenset materiale 9-12.I denne artikel beskriver vi en strømlinet protokol til kloning og ekspression screening af membranproteiner i E. coli ved hjælp af fusion til GFP som en reporter i produktionen og efterfølgende karakterisering af vaskemiddel: protein complexes (figur 1).
I protokollen beskrevet i denne artikel, er ligering uafhængig kloning i en GFP reporter vektor kombineret med fluorescensdetektion til hurtigt at screene den relative ekspression af multiple membranproteiner i E. coli. Vektorer kan ske i fire dage med primær udtryk screening tage endnu en uge. In-gel fluorescens af detergentlysater af hele celler anvendes til at rangordne ekspression rammer til yderligere analyse i en sekundær skærm. Den primære udtryk skærmen som præsenteres ikke kræver nogen specialudstyr bortset fra en rysteinkubator egnet til dyrkning celler i dybe godt blokke. Alle andre væskehåndtering involverer 96-brønds SBS plader kan udføres ved anvendelse af multi-kanal pipetter. Protokollen kan let modificeres til at omfatte andre E. coli-stammer dyrket under forskellige ekspressionssystemer betingelser (f.eks lavere temperatur). I tilfælde af LEMO21 (DE3) titrering niveauet af rhamnose (fra 0 til 2,0 mM)tilsat til at modulere hastigheden af transkription kan øge niveauet af ekspression af nogle membranproteiner 7. Andre end DDM Rengøringsmidler kan anvendes til ekstraktion i den primære screening selvom strengere vaskemidler kan solubilisere proteiner fra inklusionslegemer og giver derfor falske positiver. Er klart, at mere omfattende den første skærm bliver, jo mere tidskrævende eksperimentet.
Den sekundære skærm indebærer fremstilling af en total membranfraktion fra udtrykket hits identificeret i den primære screening. Dette er et kritisk trin, som det vil bekræfte lokalisering af fusionsproteinerne til membranen af E. coli-celler. Efterfølgende ekstraktion af GFP-fusionsproteinet i forskellige detergenter overvåges ved fluorescens-detekteret gelpermeationskromatografi af solubiliseret materiale at vurdere mono-dispersitet detergent-protein-komplekser. Dette er endnu et afgørende skridt, da den identificerer den mest hensigtsmæssige vaskemiddel tilsolubilisering af membranprotein til efterfølgende nedstrøms forarbejdning. Erfaringen viser dog, at kan være nødvendig yderligere optimering af valget af vaskemiddel (r) under oprensning og krystallisering. Bevis for ensartet adfærd i forskellige detergenter, herunder dem med en relativt lille micelle størrelse (f.eks LDAO) synes at være god indikator for en tilbøjelighed til at danne godt diffrakterende krystaller mindste for prokaryote membranproteiner 14. I denne henseende viste profil for membranprotein i figur 2B vises meget positiv.
Den største fordel ved at anvende en GFP reporter er, at det giver en hurtig udlæsning af ekspression i un-oprensede prøver. En ulempe er, at GFP-fusionsproteinet skal fjernes under oprensning af proteinet til krystallisation. I tilfælde af vektorer, der anvendes her, en rhinovirus 3C protease-site muliggør spaltning af GFP. Alternativt er det ligetilat re-clone kandidat proteiner, der er identificeret i skærmen, i vektorer, som kun tilføjer en polyhistidin eller anden affinitetstag til efterfølgende rensning. Dette forudsætter, at fusion til GFP er ikke nødvendig til ekspression. Det vigtigste alternativ til fusion til GFP til påvisning af membranprotein udtryk og opløselighed er at tilsætte kun en histidinmærke. Men denne fremgangsmåde kræver typisk starter med en membran fraktion 15, som til evaluering af mange varianter vil blive meget tidskrævende.
Sammenfattende er det vigtigste formål med protokollen beskrevet i denne artikel for at gøre det muligt for et stort antal membranprotein sekvensvarianter til hurtigt evalueres med hensyn til udtryk og vaskemiddel solubilization og prioriteres til nærmere analyse.
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name of Material | Company | Catalog Number |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |