Os mosquitos transmissores da malária têm uma série de características epidemiologicamente importantes que só podem ser detectadas usando técnicas moleculares. Utilizando uma plataforma de genotipagem SNP baseada em MALDI-TOF, desenvolvemos um ensaio para detectar simultaneamente várias características-chave (espécie, resistência a inseticidas, infecção parasitária e escolha do hospedeiro) de vetores da malária.
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Artigo de método
Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores
Neste artigo
Resumo
Resumo
O complexo de espécies Anopheles gambiae inclui a maior mosquitos transmissores da malária na África. Porque estas espécies são de tal importância médica, várias características são tipicamente caracterizados por meio de ensaios moleculares para auxiliar em estudos epidemiológicos. Essas características incluem a identificação das espécies, resistência a inseticidas, estado de infecção do parasita, e preferência de acolhimento. Dado que as populações do complexo Anopheles gambiae são morfologicamente indistinguíveis, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) é tradicionalmente usado para identificar as espécies. Uma vez que a espécie é conhecida, vários ensaios a jusante são rotineiramente realizados para elucidar outras características. Por exemplo, as mutações conhecidas como KDR em um gene par conferir resistência contra o DDT e piretróides. Além disso, ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA) ou Plasmodium ensaios de PCR de detecção do DNA do parasita são usados para detectar parasitas presentes nos tecidos de mosquito. Por último, uma combinaçãn de PCR e digeridos com enzimas de restrição pode ser utilizado para elucidar preferência hospedeira (por exemplo, humano versus animais de sangue) por rastreio de farinha de sangue para mosquitos de ADN específico do anfitrião. Nós desenvolvemos um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos os ensaios acima mencionados numa única multiplex 33SNPs genotipagem reacção durante 96 ou 384 amostras de cada vez. Porque o MDA inclui vários marcadores para as espécies, a detecção de Plasmodium, e identificação sanguíneo hospedeiro, a probabilidade de gerar falsos positivos ou negativos é muito reduzida a partir de ensaios anteriores que incluem apenas um marcador por traço. Este ensaio robusto e simples pode detectar essas características-chave do mosquito de forma rentável e em uma fração do tempo de ensaios existentes.
Introdução
Arabiensis Anopheles, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae são os principais vetores responsáveis pela transmissão da malária na África 1. Estas três espécies são morfologicamente indistinguíveis 2 e só pode ser distinguido por testes moleculares 3-9. Além disso, existem muitos ensaios a jusante rotineiramente realizados para auxiliar genética epidemiológicos e populacionais estudos. Estas incluem: (1) um ensaio de genotipagem para ilhas de especiação 10-12, (2) um ensaio de genotipagem reconhecendo SNPs não sinônimas no 1014 th posição do aminoácido códon do gene para (a resist....
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Protocolo
1. Amplificação por PCR
- Misturar todos os iniciadores de PCR (Ver Tabela S1 suplementar) em um microtubo de 1,5 mL. Cada SNP tem dois iniciadores (directo e inverso). Certifique-se de que a concentração de estoque de cada um dos iniciadores de PCR é mantida a 100 uM. Faça a mistura de iniciadores suficiente para 500-1.000 reações para reduzir pipetagem erro e tempo no banco (ver Tabela S2 suplementar). Se desejado, preparar alíquotas de 100-200 reacções por tubo, e armazenar a -20 ° C.
- Prepare PCR cocktail como descrito no protocolo do fabricante (Tabela 1). O volume para 96 reacções inclui um excesso de 20%. Vortex o tubo contendo o cocktail d....
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Resultados
A identificação das espécies:
Os cinco SNPs seguintes juntos identificar três espécies (A. arabiensis coluzzii A. e A. gambiae) (Tabela 4). Se a amostra não é uma das três espécies, os três SNPs (01073-213, 04.679-157 e 10313 -052) não conseguem amplificar.
genótipo kdr para inferir resistência a inseticidas:
A 1014 ° codão do canal de sódio parágrafo te.......
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Discussão
O MDA é composto por cinco etapas principais: amplificação de PCR, fosfatase alcalina de camarão (SAP) de reacção, de extensão SNP, o produto de extensão condicionado, e de matriz assistida por laser de dessorção / ionização - tempo de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa de 33-37. O primeiro passo de amplificação de PCR amplifica ADN que flanqueia cada SNP, de modo que o ADN molde suficiente estará disponível no passo de extensão de SNP. A reação SAP neutraliza dNTPs não utilizados que possam interferir c.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Drs. Anthony Cornel e Laura Norris na UC Davis e Dr. Katharina Kreppel na Universidade de Glasgow para a prestação de espécimes de mosquitos da Tanzânia. Agradecemos Ms. Smita Das e Dr. Douglas Norris da Johns Hopkins School of Public Health para a partilha de amostras de mosquitos da Zâmbia. Agradecemos também o Sr. Lee V. Millon do Laboratório de Genética Veterinária para o treinamento no projeto ensaio. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder R01AI 078.183 e R21AI062929.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF espectrometria de massa para aplicações genômicas para análise de ácidos nucléicos. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfere produtos de reação iPLEX concluídos para o |
| conjunto de reagentes de genotipagem SpectroCHIP iPLEX Gold | Sequenom | 10158 | Reagentes usados para o ensaio iPLEX, incluindo o kit SAP. |
Referências
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gamb....
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Reimpressões e permissões
