La membrana corioalantoidea (CAM) del pollo es inmunodeficiente y altamente vascularizada, lo que la convierte en un modelo natural in vivo de crecimiento tumoral y angiogénesis. En este protocolo, describimos un método confiable para el crecimiento de tumores tridimensionales de carcinoma hepatocelular vascularizado (CHC) utilizando el ensayo CAM.
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En este artículo
Resumen
Resumen
La membrana corioalantoidea de pollo (CAM) comienza a desarrollarse el día 7 después de la fecundación y madura por día 12. El CAM es naturalmente inmunodeficientes y altamente vascularizado, por lo que es un sistema ideal para la implantación del tumor. Además, la CAM contiene proteínas de matriz extracelular tales como fibronectina, laminina, colágeno, la integrina alfa (v) beta3, y MMP-2, por lo que es un modelo atractivo para estudiar la invasión tumoral y la metástasis. Los científicos han tardado mucho provecho de la fisiología de la CAM utilizando como modelo de la angiogénesis. Más recientemente, el ensayo de CAM se ha modificado para que funcione como un sistema modelo de xenoinjerto in vivo para varios tipos de cáncer que sirve de puente entre el trabajo básico in vitro y modelos animales de cáncer más complejos. El ensayo de CAM permite el estudio del crecimiento del tumor, las terapias anti-tumorales, y pro-tumorales vías moleculares en un sistema biológicamente relevante que es a la vez en tiempo y costo efectiva. Aquí se describe el desarrollo de la CAM xenograft modelo de carcinoma hepatocelular (HCC) con tasas de supervivencia de embriones de hasta 93% y tumor fiable tomar conduce al crecimiento de los tumores en tres dimensiones, vascularizados.
Introducción
El carcinoma hepatocelular (CHC) es la 3ª causa de mortalidad por cáncer en el mundo 1. Actualmente sólo el 30% de los pacientes con HCC son elegibles para los tratamientos quirúrgicos potencialmente curativos 2, y la quimioterapia sistémica no es eficaz 3. Por lo tanto, hay una necesidad apremiante insatisfecha clínico para nuevas terapias HCC, y el desarrollo de sistemas de modelos adecuados para la prueba eficiente de nuevos agentes. La membrana corioalantoidea (CAM) de ensayo polluelo proporciona un método reproducible y rentable, y rápido rendimiento medio de probar posibles fármacos anti-tumorales in vivo.
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Protocolo
La incubación 1. Huevo
- Obtener 8 días de edad huevos embrionados libres de patógenos específicos.
- Coloque los huevos en rotación bandeja de huevos, extremos estampadas hacia arriba y coloque la bandeja giratoria dentro de una incubadora de huevos. Incubar los huevos durante 48 horas a 36 ° C y 50% de humedad.
2. Dejar caer la CAM y la apertura de los huevos
- Recoger los huevos de la incubadora. Coloque los huevos en la canasta de huevos, estampadas hacia arriba, y llevar ante la campana de flujo laminar.
- Apague las luces de la sala y la capilla.
- Mantenga el extremo sellado del huevo....
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Resultados
Imágenes representativas de los pasos clave en el protocolo se muestran aquí. Figura 1A muestra el uso de la candler visualizar el embrión en desarrollo, el saco de aire, y la vasculatura de la CAM. Figura 1B-1C muestran el proceso de abandonar la CAM al hacer los dos orificios y luego aplicando presión negativa utilizando la bombilla de seguridad, y la Figura 1d muestra una eliminado satisfactoriamente CAM con una gran burbuja de aire bajo el orificio .......
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Discusión
Varios pasos clave en este protocolo muy probablemente explican la mejora de la supervivencia embrionaria, así como una mayor fiabilidad de crecimiento del tumor. Dejar caer la CAM alejado de la cáscara aplicando succión a la bolsa de aire es menos invasivo que otros métodos existentes (utilizando una aguja para extraer la albúmina del huevo, disección roma, etc.). El uso de un alfiler estéril para crear los dos pequeños agujeros necesarios para este método es la parte más difícil del protocolo. El uso de una fuerza exc.......
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Divulgaciones
A.S. recibe fondos de la compañía farmacéutica Advaxis para apoyar un ensayo clínico iniciado por el investigador.
Agradecimientos
A.S. fue parcialmente financiado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (5R03DE021741-02) y el Instituto Nacional del Cáncer (1K08CA154963-01A1).
El Instituto Médico Howard Hughes proporcionó fondos para M.L. a través del Programa de Becarios de Investigación Médica del HHMI.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Huevos incubados de primera calidad | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Incubadoras de huevos | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Bandejas de huevos giratorias | GQF | 1611 Volteador | |
| Vela de huevos | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Herramienta rotativa Dremel 100 con disco de corte 15/16 | Dremel | 100-N/7 | |
| Pinzas estériles, alfiler, tijeras de disección, cinta | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Viales criogénicos, rosca externa con arandela de silicona | Corning | 430659 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
Referencias
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M.
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Reimpresiones y permisos
