Radial Mobilitet og cytotoksiske funktion retroviral replikerende vektor transducerede, ikke-klæbende Alloresponsive T-lymfocytter
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
Vi rapporterer en ny tilpasning af Radial Monolayer Cell Migration assay først rapporteret at måle den radiale vandring af adhærente tumorceller på ekstracellulære matrixproteiner, til måling af motiliteten af fluorescens-mærkede, ikke-klæbende humane eller murine effektorceller immunceller. Denne teknik anvender en rustfri manifold og 10-godt Teflon dias til fokalt deponere ikke-klæbende T-celler i brønde fremstillet med enten sammenflydende tumor cellemonolag eller ekstracellulære matrixproteiner. Lys og / eller multi-kanal fluorescens mikroskopi anvendes til at spore bevægelse og adfærd effektorcellerne over tid. Fluorescerende farvestoffer og / eller virale vektorer, der koder for fluorescerende transgener anvendes til differentielt at mærke de celletyper til billeddannelse. Denne metode adskiller sig fra tilsvarende type in vitro-analyser, der sporer vandret eller lodret migration / invasion udnytte slide kamre, agar eller Transwell plader. Analysen giver detaljerede billeddata til be indsamlet med forskellige celletyper kendetegnet ved særlige fluorescerende markører; endog specifikke subpopulationer af celler (dvs. transduceret / nontransduced) kan overvåges. Surface intensitet fluorescens plots genereres ved hjælp af specifik fluorescens kanaler, der svarer til migrerende celletype. Dette giver mulighed for bedre visualisering af det ikke-klæbende immuncelle mobilitet på bestemte tidspunkter. Det er muligt at indsamle bevismateriale for andre effektorcellepopulationer funktioner, såsom cytotoksicitet eller overførsel af virale vektorer fra effektor at målrette celler, så godt. Således tillader fremgangsmåden forskere mikroskopisk dokumentere celle-til-celle-interaktioner af differentielt mærket, ikke-klæbende med adhærente celler af forskellige typer. Sådanne oplysninger kan være særlig relevant i vurderingen af biologisk manipulerede eller aktiverede immune celletyper, hvor visuel dokumentation for funktionalitet ønskes med tumor målceller før deres anvendelse til kræftbehandling.
Introduction
Radial monolag cellemigrationsassay blev oprindeligt udviklet til at måle infiltrative egenskaber adhærente tumorceller 1-4 på objektglas coatet med ekstracellulær matrix (ECM) proteiner 5-7 eller med individuelle ECM komponenter, såsom fibronectin eller laminin 1,2. Teknikken involveret podning en enkelt cellesuspension af tumorceller i centrum af brønde med en rustfri stål-celle sedimentation manifold (CSM). Efter sedimentation ville tumorcellerne holde sig til bunden af brønden og ændringen i diameter af den oprindelige cellepopulation over tid blev anvendt til at etablere en hastighed på vandret motilitet. Radial monolag cellemigrationsassay forefindes et visuelt fordel over andre eksisterende metoder, der anvendes Transwell plader assay in vitro migrerende funktioner af celler; disse assays er ikke-befordrende for billeddannelse 8. Så godt, det også en stor mængde af frihed i valget af tidspunkternes Når migration vurderes, uden nogen øvre grænse for antallet af tidspunkter en forsker kan vælge at billedet efter bundfældning.
Fordi evnen til at migrere er en vigtig funktion for ikke-adhærente celler, især i området for immunterapi, eller hvor de kan anvendes som tilførselsvehikler til virale vektorer, vi tilpasset brugen af CSM at evaluere migration af ikke-klæbende celler typer på tumor cellemonolag, i tillæg til ECM-proteiner. Den ekstra fordel, mikroskopisk visualisering af migration af ikke-adhærente celler på levedygtige tumor cellemonolag på komplekse ECM isoleret fra tumor, eller på de enkelte ECM komponenter gør dette assay alsidig. Analyser, der beskæftiger brønde belagt med et enkelt ekstracellulært protein ikke præcist afspejler ECM væv substrat eller tumor cellerne ville migrere gennem in vivo.
Her brugte vi alloreaktive cytotoksiske T-lymfocytter (alloCTL), lysfølsomme til større histocompatibility kompleks (MHC) proteiner ved hjælp af en-vejs blandet lymfocyt tumorcellelinier reaktioner (MLTR) eller blandede lymfocyt-reaktioner (MLR) 9, som vores repræsentative ikke-klæbende celletype. Vi testede celler af både human og murin oprindelse. Da migration blev målt på tumor monolag, tumorcellerne anvendte var enten delvis relevante mål, viser nogle af de samme MHC proteiner, der findes på den celle population anvendes til at bevidstgøre effektorerne eller fuldt relevante mål, med et komplet sæt af MHC-molekyler, at effektorer var blevet sensibiliseret mod. I nogle eksperimenter anvendte vi fluorescerende CellTracker Red CMPTX eller celleproliferation farvestof eFluor 670 til at skelne mellem effektorceller og målceller. Vi har også anvendt transduktion med virale vektorer, der koder for fluorescerende proteiner som en ekstra måde at visualisere cellerne. For visse analyser, vi transduceret den alloCTL med retrovirale replikerende vektorer (RRV) koder for Emerald Green (EMD) fluorescerende protein 10,11; for othERS blev tumorceller transduceret med lentivirale vektorer, der koder for mStrawberry.
Den alloCTL blev podet gennem en kanal af manifolden ind i midten af enten tumor- cellemonolag eller ECM høstet fra tumor cellemonolag. Adhærente og non-adhærente celle-interaktioner blev visualiseret ved lys og / eller ved fluorescensmikroskopi over tid. Forstyrrelser i tumor cellemonolaget ved lav effekt, eller tumorceller med fragmenterede kerner ved høj effekt var indikatorer for celle skade ved lyse og apoptose hhv. Vi skabte digitalt overflade intensitet fluorescerende kort, der viser migration af ikke-klæbende fluorescerende T-celler over enkeltlagskulturer. Vi bemærkede også cytotoksicitet affødt til det klæbende gliom cellemonolaget efter klyngedannelse af overlejret ikke-klæbende alloCTL. Samt, var vandret transduktion af RRV-EMD fra alloCTL til gliom monolag overholdes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumorceller i en enkelt cellesuspension blev pipetteret i brønde i en Teflon-maskeret objektglas. Cellerne fik lov at klæbe og derefter dannede monolag i en befugtet 5% CO2, 37 ° C inkubator (figur 1A). Etablerede monolag eller ECM proteiner fra monolaget kunne høstes til disse assays (Figur 1B). T-lymfocytter mærket med vitale fluorescerende farvestoffer eller transduceret med vektorer, der koder for EMD blev podet i centrum af brønden ved hjælp af en CSM. Evnen af ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Delvist understøttet af NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Number UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, og Joan S. Holmes Memorial Research Fund. MJH og GCO modtaget støttet fra Joan S. Holmes Memorial Postdoc Fellowship på UCLA. CSM-enheden blev opnået fra Creative videnskabelige metoder: www.creative-sci.com. Lentivirusvektoren blev modtaget fra UCLA Vector Core, som støttes af CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. f. D. C. a. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
