Summary

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Published: March 19, 2015
doi:

Summary

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Abstract

A infecção por influenza está associada com cerca de 36.000 mortes e mais de 200 mil internações por ano nos Estados Unidos. O surgimento contínuo de novas estirpes do vírus da influenza, devido a mutação e de re-sortido complica o controlo do vírus e necessita o desenvolvimento permanente de novas drogas e vacinas. O estudo baseado em laboratório da gripe requer um método confiável e de custo eficaz para a propagação do vírus. Aqui, um protocolo global prestada para influenza A propagação do vírus em ovos de galinhas férteis, que consistentemente produz stocks virais título elevado. Em breve, isentos de agentes patogénicos (SPF) de ovos de galinha fertilizados de soro são incubadas a 37 ° C e 55-60% de humidade durante 10-11 dias. Durante este período, o desenvolvimento do embrião pode ser facilmente monitorizado utilizando um candler ovo. A inoculação do virus é realizada por injecção de estoque de vírus na cavidade alantóide usando uma agulha. Após 2 dias de incubação a 37 ° C, os ovos sãorefrigeradas durante pelo menos 4 horas a 4 ° C. A casca de ovo de cima do saco de ar e a membrana corioalantóica são então cuidadosamente aberto e o fluido alantóide que contém o vírus é colhido. O fluido é limpa de detritos por centrifugação, aliquotado e transferido para -80 ° C para armazenamento a longo prazo. A grande quantidade (5-10 ml de fluido por ovo contendo vírus) e título de alta vírus quais geralmente são obtidas com este protocolo fez com que o uso de ovos para a preparação de vírus nosso método favorável, em particular, para estudos in vitro que necessitem de grandes quantidades de vírus em que são necessárias doses elevadas da mesma reserva de vírus.

Introduction

Influenza A continua a ser uma grande ameaça para a saúde humana. É uma doença respiratória potencialmente devastador com uma grande carga global causando até 500.000 mortes no mundo anualmente 1. Os vírus da gripe estão na família Orthomyxoviridae e levar de cadeia simples RNA 8 negativas-sense em seu genoma 1,2. A mutabilidade alta (isto é, "deriva" antigénico) do genoma viral impede a imunidade a longo prazo. Além disso, a gripe é cada vez mais resistentes aos medicamentos anti-virais 3.

A pandemia de gripe H1N1 2009 em destaque todas as questões desafiadoras associados à doença influenza (estirpe pandémica, a resistência anti-viral, a produção de vacinas em atraso). A formulação da vacina é determinado anualmente pela Organização Mundial de Saúde para as cepas de influenza provavelmente patogênicos (um para cada H1N1, H3N2 e influenza B) 4. Uma vez que este método é baseado na estirpe da gripe previus, estirpes patogénicas são ocasionalmente incorretamente identificado e eficácia da vacina cai drasticamente. Além disso, o surgimento de novas cepas de influenza pode contornar esses programas preventivos que causam doenças pandêmicas 2.

A criação de uma vacina contra a gripe universal tem sido difícil 5. Portanto, a pesquisa deve continuar na compreensão da patogênese da lesão pulmonar. Para pesquisas de laboratório instalação, vários métodos foram desenvolvidos para o isolamento viral e propagação 6. Os vírus influenza humanos pode ser amplificado em uma variedade de substratos de células de mamíferos. No entanto, gerando vírus de título elevado em grandes quantidades são atingidas mais facilmente em ovos embrionados. O protocolo seguinte descreve uma técnica para a propagação de vírus influenza A e armazenamento de stocks de vírus existentes.

Protocol

NOTA: Observações gerais: executar todos os procedimentos que envolvem a manipulação do ovo em condições estéreis, e uma técnica estéril deve ser usado em conformidade. Pré-limpa todos os equipamentos com etanol 70% antes do uso. Em geral, a inoculação e colheita vírus influenza deve ser realizado em um laboratório BSL-2. No entanto, se esse protocolo é usado para propagar muito mais patogênico vírus da gripe (por exemplo, cepas pandêmicas e pré-pandemia, estirpes que representam um perigo pa…

Representative Results

Vários métodos têm sido desenvolvidos para titular o vírus da gripe. Uma consideração na escolha de um método adequado é que alguns determinar partículas totais, independentemente da viabilidade (por exemplo, o ensaio de hemaglutinina), enquanto outros são baseados em infectividade, que avaliará virions viáveis ​​(por exemplo, teste de placas) 6. Aqui, o título virai de líquido alantóico recolhidas a partir de ovos de galinha inoculados com um vírus da gripe adaptada-rato…

Discussion

Influenza provoca uma grande carga global de doenças, eo trabalho continua para a compreensão da patogênese da lesão pulmonar 7. Para facilitar a investigação nesta doença mortal, vários métodos têm sido desenvolvidos para propagar o vírus da gripe 6. Aqui, descrevemos uma técnica para produzir vírus influenza em ovos de galinha. A vantagem deste método é que é altamente reprodutível e resulta em grandes quantidades de estoques de vírus de título elevado gripe, o que é muitas ve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Phosphate buffered saline (PBS) Cellgro  21-040-CV
serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs  VALO BioMedia n/a
humidified egg incubator  FARM iNNOVATORS Model 2100
automatic egg turner FARM iNNOVATORS Model 3200
egg candler FARM iNNOVATORS Model 3300 
1 ml syringe BD Bioscience 309659
18G needle BD Bioscience 305196
20G / 22G needle BD Bioscience 305176 / 305156
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Ethanol, >99.5% Sigma-Aldrich 459844 diluted to 70% using water
glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. Model 1105
glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. 220-34ZIP30
MDCK cells ATCC CRL-2935
Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% Lampire Biological Laboratories 724908

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
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Cite This Article
Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (97), e52421, doi:10.3791/52421 (2015).

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