Cet article décrit un test basé sur la croissance de levure pour la détermination des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Il fait également la démonstration d’une méthode d’extraction rapide des protéines de levure, adaptée au western blot pour confirmer biochimiquement les exigences de dégradation. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d’une variété de protéines.
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Article de méthode
Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La dégradation des protéines réglementé est crucial pour pratiquement toutes les fonctions cellulaires. Une grande partie de ce qui est connu sur les mécanismes moléculaires et génétiques exigences pour la dégradation des protéines eucaryotes a été initialement créé en Saccharomyces cerevisiae. Analyses classiques de la dégradation des protéines se sont appuyés sur pulse-chase et cycloheximide-chase méthodes biochimiques. Bien que ces techniques fournissent des moyens sensibles pour observer la dégradation des protéines, ils sont laborieux, de temps, et à faible débit. Ces approches ne sont pas aptes à la sélection rapide ou à grande échelle pour des mutations qui empêchent la dégradation des protéines. Ici, un test basé sur une croissance de la levure pour l'identification facile des exigences génétiques pour la dégradation des protéines est décrite. Dans ce dosage, une enzyme rapporteur nécessaire à la croissance dans des conditions sélectives spécifiques est fusionnée à une protéine instable. Les cellules dépourvues de l'enzyme rapporteur endogène mais qui expriment la protéine de fusion peut se développer sous sélective conditions que lorsque la protéine de fusion est stabilisé (lorsque la dégradation des protéines est compromise). Dans l'essai de croissance décrit ici, des dilutions en série de type sauvage et des cellules de levure mutantes qui hébergent un plasmide codant pour une protéine de fusion sont déposés sur un milieu sélectif et non-sélectif. Croissance dans des conditions sélectives est compatible avec la dégradation dépréciation par une mutation donnée. L'abondance de la protéine accrue devrait être confirmé biochimiquement. Procédé pour l'extraction rapide de protéines de levure sous une forme appropriée pour l'électrophorèse et transfert de Western est également démontrée. Une lecture basée sur la croissance pour la stabilité de la protéine, combinée avec un simple protocole d'extraction de protéines pour l'analyse biochimique, facilite l'identification rapide des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d'une variété de protéines de courte durée. Dans l'exemple présenté, l'enzyme His3, qui est nécessaire pour la biosynthèse de l'histidine, a été fusionnéà DEG1 -Sec62. DEG1 -Sec62 est prévue pour dégradation après ce qu'il se engage aberrante le réticulum endoplasmique translocon. Cellules hébergeant DEG1 -Sec62-His3 sont capables de croître dans des conditions sélectives lorsque la protéine a été stabilisé.
Introduction
La dégradation sélective des protéines est essentielle à la vie eucaryote, et la dégradation de la protéine altérée contribue à un certain nombre de maladies, y compris plusieurs types de cancer, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, et la fibrose kystique 1-5. Le système ubiquitine-protéasome (UPS), qui catalyse la dégradation sélective des protéines, est une cible thérapeutique émergeant de ces conditions 6-10. ubiquitine ligases attachent de manière covalente des polymères de l'acide 76-ubiquitine aminés aux protéines 11. Les protéines qui ont été marqués avec des chaînes de polyubiquitine sont reconn....
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Protocole
1. levure croissance essai pour identifier des mutants candidats défectueux dans la dégradation des protéines
- Transform de type sauvage et des cellules de levure mutantes avec un plasmide codant pour une protéine fusionnée instable, en cadre, à une enzyme reporter métabolique.
- Ensemencer transformants dans 5 ml de synthèse défini (SD) de milieu minimal qui est sélectif pour les cellules portant des molécules plasmidiques. Incuber pendant une nuit à 30 ° C, en rotation.
- Mesurer la densité optique à 600 nm (DO600) de chaque culture d'une nuit.
REMARQUE: Après incubation pendant une nuit, les cellules en culture peut ....
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Résultats
Pour illustrer cette méthode, l'enzyme His3 a été fusionné à l'extrémité carboxy-terminale du modèle réticulum endoplasmique (RE) associée au gène de dégradation (ERAD) substrat, DEG1 -Sec62 (figure 2A) pour créer DEG1 -Sec62-His3 (Figure 3) . DEG1 -Sec62 représente un membre fondateur d'une nouvelle classe de substrats ERAD qui sont ciblées suivant, les association persistante aberrante avec le translocon, le canal principal responsable pour dépla.......
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Discussion
La méthodologie présentée ici permet la détermination rapide et confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans des cellules de levure. Ces expériences mettent en évidence l'utilité et la puissance de la levure comme modèle organisme eucaryote (plusieurs excellentes critiques de levure biologie et compilations de protocoles pour la manipulation, le stockage et la manipulation de cellules de levure (par exemple 41-44) sont disponibles pour les enquêteurs de.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions les membres actuels et anciens du laboratoire Rubenstein pour fournir un environnement de recherche et enthousiaste. Nous remercions Ryan T. Gibson pour l'assistance dans l'optimisation de protocole. Nous remercions Mark Hochstrasser (Université de Yale) et Dieter Wolf (Universität Stuttgart) pour les souches de levures et plasmides. Nous remercions nos lecteurs anonymes pour leur aide dans l'amélioration de la clarté et l'utilité de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche de la section de l'Université Ball State de Sigma Xi à SGW, un National Institutes of Health subvention (R15 GM111713) au DME, une bou....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Souches de levure, plasmides, milieux standard et composants | souhaités Les souches de levure présentant les mutations souhaitées peuvent être générées dans le laboratoire de l’investigateur. Des levures de type sauvage et une variété de mutants sont également disponibles dans le commerce ( par exemple auprès de GE Healthcare). Des plasmides codant pour des protéines de fusion peuvent être générés dans le laboratoire de l’investigateur. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Inhibiteur compétitif de l’enzyme His3. Peut être inclus dans un essai de croissance moyen à augmenter à l’aide des constructions de rapporteur His3. |
| L’endoglycosidase H (forme recombinante de Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | Peut être utilisée pour évaluer la N-glycosylation des protéines ; compatible avec les concentrations de SDS et de bêta-mercaptoéthanol trouvées dans 1x tampon d’échantillon Laemmli. |
| Tubes jetables en verre borosilicaté | Fisher Scientific | 14-961-32 | Disponible auprès d’une variété de fabricants |
| Incubateur à température régulée (p. ex. Incubateur Heratherm Modèle IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Disponible auprès d’une variété de fabricants |
| Nouveau-Brunswick Tambour interchangeable pour tubes de 18 mm (rouleau tubulaire) | Nouveau-Brunswick | M1053-0450 | Il est recommandé d’utiliser un rouleau tubulaire pour maintenir en suspension des cultures de levure pendant la nuit. Un agitateur à plate-forme ou un rouleau tubulaire peut être utilisé pour maintenir les grandes cultures en suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | À utiliser avec le rouleau tubulaire |
| Spectrophotomètre SmartSpec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | Disponible auprès d’une variété de fabricants |
| Plaques microtests stériles à fond plat à 96 puits avec couvercle emballé individuellement | Sarstedt | 82.1581.001 | Disponible chez une variété de fabricants |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & mu; l | Gilson | F14401 | Disponible auprès d’une variété de fabricants ; ; ; ; |
| [en-tête] | |||
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu ; l | Gilson | F14403 | Des pipettes monocanaux et multicanaux sont utilisées à différentes étapes du protocole. Alors que les pipettes multicanaux réduisent la charge de pipetage à plusieurs étapes, les pipettes monocanaux peuvent être utilisées tout au long du protocole. Disponible auprès d’une variété de fabricants. |
| Centrifugeuse 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Le rotor vendu avec contient des tubes de microcentrifugation de 1,5 et 2,0 ml. Le rotor peut être remplacé par un autre qui contient des tubes coniques de 15 ml et 50 ml. |
| Système d’imagerie de plaques (p. ex. Système Gel Doc XR+) | Bio-Rad | 170-8195 | Une variété de systèmes peuvent être utilisés pour imager les plaques, y compris des systèmes d’imagerie sophistiqués, des scanners informatiques et des téléphones avec appareil photo. |
| Rotor à angle fixe F-35-6-30 avec couvercle et adaptateurs pour centrifugeuse Modèle 5430/R, tubes coniques 15/50 ml, 6 places | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml Tube à bouchon à vis sérigraphié 17 x 20 mm conique, polypropylène | Sarstedt | 62.554.205 | Disponible auprès de différents fabricants |
| Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml, PCR clean, naturels | Eppendorf | 22364120 | Disponible dans une variété de fabricants |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Le bain d’eau bouillante avec plaque chauffante peut également être utilisé pour dénaturer |
| les protéines Appareils de fonctionnement et de transfert SDS-PAGE, alimentations et équipements d’imagerie ou chambres noires pour SDS-PAGE et transfert à membrane | Variera selon le laboratoire et l’application | ||
| Système d’imagerie par transfert Western ( par exemple scanner Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio) | Li-Cor | 9140-01 | Variera selon le laboratoire et l’application Membranes |
| transfert EMD Millipore Immobilon PVDF | Scientific | Variera selon le laboratoire et l’application | |
| Anticorps primaires ( par exemple Phosphoglycérate kinase (Pgk1) Anticorps monoclonal, souris (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Variera selon le laboratoire et l’application |
| Anticorps secondaires (par exemple Alexa-Fluor 680 IgG anti-souris de lapin (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Variera selon le laboratoire et l’application |
Références
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmi....
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Réimpressions et autorisations
