ग्रोथ आधारित निर्धारण और प्रोटीन गिरावट के लिए जेनेटिक आवश्यकताएँ की बायोकेमिकल पुष्टि में<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.
Abstract
नियमित प्रोटीन गिरावट लगभग हर सेलुलर समारोह के लिए महत्वपूर्ण है। आणविक तंत्र और यूकेरियोटिक प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं के बारे में जाना जाता है की बहुत शुरू में Saccharomyces cerevisiae में स्थापित किया गया था। प्रोटीन गिरावट के शास्त्रीय विश्लेषण के जैव रासायनिक पल्स-चेस और cycloheximide-पीछा के तरीके पर भरोसा किया है। इन तकनीकों प्रोटीन गिरावट के अवलोकन के लिए संवेदनशील साधन उपलब्ध कराते हैं, वे श्रमसाध्य, समय लेने वाली है, और कम-से throughput हैं। इन तरीकों प्रोटीन गिरावट को रोकने कि म्यूटेशन के लिए तेजी से या बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। इधर, प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं की सतही पहचान के लिए एक खमीर विकास आधारित परख में वर्णित है। इस परख में, विशिष्ट चयनात्मक शर्तों के तहत विकास के लिए आवश्यक एक पत्रकार एंजाइम एक अस्थिर प्रोटीन से जुड़े हुए है। प्रकोष्ठों अंतर्जात संवाददाता एंजाइम की कमी है, लेकिन संलयन प्रोटीन sele के तहत विकसित कर सकते हैं व्यक्तसंलयन प्रोटीन स्थिर है केवल जब ctive शर्तों (यानी प्रोटीन गिरावट के साथ छेड़छाड़ की है)। यहाँ वर्णित विकास परख में, जंगली प्रकार और एक संलयन प्रोटीन एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड शरण उत्परिवर्ती खमीर कोशिकाओं के धारावाहिक dilutions चयनात्मक और गैर चयनात्मक माध्यम पर देखा जाता है। चयनात्मक शर्तों के तहत विकास के लिए एक दिया उत्परिवर्तन से गिरावट हानि के साथ संगत है। वृद्धि की प्रोटीन बहुतायत को biochemically पुष्टि की जानी चाहिए। वैद्युतकणसंचलन और पश्चिमी सोख्ता के लिए उपयुक्त एक फार्म में खमीर प्रोटीन का तेजी से निकासी के लिए एक विधि को भी प्रदर्शन किया है। जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए प्रोटीन निकासी के लिए एक सरल प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त प्रोटीन स्थिरता के लिए एक विकास आधारित readout, प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं की तेजी से पहचान की सुविधा। इन तकनीकों में अल्पकालिक प्रोटीन की एक किस्म की गिरावट पर नजर रखने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रस्तुत उदाहरण में, हिस्टडीन जैवसंश्लेषण के लिए आवश्यक है जो HIS3 एंजाइम, इनकार किया गया थायह aberrantly endoplasmic जालिका translocon संलग्न बाद Deg1 को -Sec62। Deg1 -Sec62 गिरावट के लिए लक्षित है। Deg1 -Sec62-HIS3 शरण कोशिकाओं में प्रोटीन स्थिर हो गया था जब चयनात्मक शर्तों के तहत विकसित करने में सक्षम थे।
Introduction
चयनित प्रोटीन गिरावट यूकेरियोटिक जीवन के लिए आवश्यक है, और बदल प्रोटीन गिरावट कैंसर के कई प्रकार, neurodegenerative रोग, हृदय रोग, और सिस्टिक फाइब्रोसिस 1-5 सहित चिकित्सा शर्तों के एक नंबर के लिए योगदान देता है। चयनात्मक प्रोटीन गिरावट उत्प्रेरित जो ubiquitin-Proteasome प्रणाली (यूपीएस), इन शर्तों के 6-10 के लिए एक उभरती हुई चिकित्सीय लक्ष्य है। Ubiquitin ligases covalently प्रोटीन से 11 76 एमिनो एसिड ubiquitin की पॉलिमर देते हैं। Polyubiquitin चेन के साथ चिह्नित किया गया है कि प्रोटीन मान्यता प्राप्त है और ~ 2.5 megadalton 26S द्वारा 12 Proteasome proteolyzed कर रहे हैं। मॉडल यूकेरियोटिक जीव Saccharomyces cerevisiae (नवोदित खमीर) में शुरू अध्ययन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रोटीन गिरावट तंत्र की व्याख्या में मूलभूत कर दिया गया है। यूपीएस के पहले प्रदर्शन किया शारीरिक सब्सट्रेट MATα2 13 खमीर ट्रांसक्रिप्शनल repressor थायूपीएस के 14, और कई अत्यधिक संरक्षित घटकों पहली पहचान की गई या (जैसे 15-26) खमीर में होती है। इस बहुमुखी और आनुवंशिक रूप से विनयशील मॉडल जीव में की गई खोजों ubiquitin की मध्यस्थता गिरावट के संरक्षित तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी होने की संभावना है।
सबसे यूपीएस substrates की मान्यता और गिरावट एकाधिक प्रोटीन की ठोस कार्रवाई की आवश्यकता है। इसलिए, एक दिया अस्थिर प्रोटीन की विनियमित गिरावट निस्र्पक में एक महत्वपूर्ण लक्ष्य प्रोटियोलिसिस के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं को निर्धारित करने के लिए है। स्तनधारी या खमीर कोशिकाओं में प्रोटीन गिरावट की निगरानी के लिए शास्त्रीय दृष्टिकोण (जैसे पल्स-चेस और cycloheximide-पीछा प्रयोगों 27) श्रमसाध्य और समय लेने वाली हैं। कार्यप्रणाली के इन प्रकार के प्रोटीन गिरावट का पता लगाने के लिए अत्यधिक संवेदनशील साधन उपलब्ध कराते हैं, वे प्रोटीन गिरावट या बड़े पैमाने पर screeni का तेजी से विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैंप्रोटीन गिरावट को रोकने कि म्यूटेशन के लिए एनजी। इधर, अस्थिर प्रोटीन की गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं की तेजी से पहचान के लिए एक खमीर विकास आधारित परख प्रस्तुत किया है।
प्रोटीन गिरावट, ब्याज (या गिरावट संकेत) के एक अस्थिर प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए खमीर विकास आधारित पद्धति में विशिष्ट परिस्थितियों में खमीर विकास के लिए आवश्यक है कि एक प्रोटीन के लिए, फ्रेम में, जुड़े हुए है। परिणाम ब्याज की अस्थिर प्रोटीन की प्रोटीन गिरावट के आनुवंशिक आवश्यकताओं को निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है कि एक कृत्रिम सब्सट्रेट है। सुविधाजनक, सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगशाला खमीर उपभेदों विशेष अमीनो एसिड या नाइट्रोजन कुर्सियां (जैसे 20,28-30) के जैवसंश्लेषण में शामिल चयापचय एंजाइमों एन्कोडिंग जीन में म्यूटेशन के एक पैनल बंदरगाह। इन एंजाइमों जिसका संश्लेषण एंजाइमों भाग लेने में exogenously प्रदान की चयापचयों के अभाव में सेलुलर प्रसार के लिए आवश्यक हैं। ऐसाअस्थिर प्रोटीन की गिरावट के लिए विकास आधारित संवाददाताओं से जो वे जुड़े हुए हैं के रूप में चयापचय एंजाइमों इस प्रकार से कार्य कर सकता है। प्रोटियोलिसिस रोकने कि म्यूटेशन गिरावट रिपोर्टर को शरण देने की कोशिकाओं चयनात्मक शर्तों के तहत विकसित करने की अनुमति होगी, क्योंकि प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं को आसानी से elucidated किया जा सकता है।
एक विकास लाभ एक विशेष उत्परिवर्तन ब्याज की प्रोटीन की प्रचुरता बढ़ जाती है कि एक अप्रत्यक्ष संकेत है। हालांकि, प्रत्यक्ष जैव रासायनिक विश्लेषण एक उत्परिवर्तन बल्कि अप्रत्यक्ष या artifactual कारणों के माध्यम से वृद्धि हुई प्रोटीन के स्तर के माध्यम से विकास कि परमिट पुष्टि करने के लिए आवश्यक है। प्रोटीन बहुतायत पर एक उत्परिवर्तन का असर करते हैं और विशेष रूप से उत्परिवर्तन नहीं बंदरगाह कि कोशिकाओं में स्थिर राज्य प्रोटीन के स्तर के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से इसकी पुष्टि की जा सकती है। उपयुक्त एक फार्म में खमीर प्रोटीन का तेजी से और कुशल निष्कर्षण (सोडियम हाइड्रोक्साइड और नमूना बफर के साथ खमीर कोशिकाओं के अनुक्रमिक ऊष्मायन) के लिए एक विधिपश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण के लिए भी 31 से प्रस्तुत किया है। साथ में, इन प्रयोगों प्रोटीन गिरावट के उम्मीदवार नियामकों की तेजी से पहचान की सुविधा।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत पद्धति तेजी से दृढ़ संकल्प और खमीर कोशिकाओं में प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं के जैव रासायनिक पुष्टि करने के लिए अनुमति देता है। इन प्रयोगों () (जैसे 41-44, हैंडलिंग, भंडा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एक सहायक और उत्साही अनुसंधान के माहौल प्रदान करने के लिए Rubenstein प्रयोगशाला के वर्तमान और पूर्व सदस्यों को धन्यवाद। हम प्रोटोकॉल अनुकूलन में सहायता के लिए रयान टी गिब्सन धन्यवाद। हम खमीर उपभेदों और प्लास्मिड के लिए मार्क Hochstrasser (येल विश्वविद्यालय) और डीटर वुल्फ (यूनिवर्सिटैट स्टटगार्ट) धन्यवाद। हम इस पांडुलिपि की स्पष्टता और उपयोगिता में सुधार करने में उनकी मदद के लिए हमारे गुमनाम समीक्षक धन्यवाद। इस काम SGW को सिग्मा ग्यारहवीं की गेंद राज्य विश्वविद्यालय अध्याय से एक अनुसंधान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था, गेंद राज्य विश्वविद्यालय से एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों (R15 GM111713) EMR के लिए, ईएमआर को एक गेंद राज्य विश्वविद्यालय की ख्वाहिश अनुसंधान पुरस्कार, और धन प्रोवोस्ट के कार्यालय और जीवविज्ञान विभाग।
Materials
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) |
Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
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