JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Vekst-baserte Fastsettelse og Biokjemisk Bekreftelse av Genetiske Krav for proteinnedbrytning i<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Published: February 16, 2015
doi:
10.3791/52428
, , ,
1Department of Biology,Ball State University, 2Division of Nephrology,Cincinnati Children’s Hospital

Summary

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Abstract

Regulert protein degradering er avgjørende for nesten alle cellulære funksjon. Mye av det som er kjent om de molekylære mekanismer og genetiske krav til eukaryote protein degradering ble opprinnelig etablert i Saccharomyces cerevisiae. Klassiske analyser av protein degradering har stolt på biokjemiske puls-jage og cykloheksimid-chase metoder. Mens disse teknikkene gir følsomme midler for å observere proteinnedbrytning, de er arbeidskrevende, tidkrevende, og lav gjennomstrømning. Disse metodene er ikke mottagelig for rask eller storskala screening for mutasjoner som hindrer protein degradering. Her er en gjærvekst-basert assay for den lette identifisering av genetiske krav til proteinnedbrytingen er beskrevet. I denne analysen blir en reporter-enzym som er nødvendig for vekst under bestemte selektive betingelser kondensert til et ustabilt protein. Celler som mangler endogen reporter-enzym, men som uttrykker fusjonsproteinet kan vokse under selective tilstander bare når fusjonsproteinet blir stabilisert (dvs. når proteinnedbrytingen er kompromittert). I veksten analysen beskrevet her, blir seriefortynninger av villtype og mutante gjærceller som inneholder et plasmid som koder for et fusjonsprotein flekket ut på selektive og ikke-selektive medium. Vekst under selektive betingelser er forenlig med nedbrytning funksjon av en gitt mutasjon. Økt protein overflod bør biokjemisk bekreftet. Fremgangsmåte for rask ekstraksjon av gjærproteiner i en form egnet for elektroforese og Western blotting er også demonstrert. En vekstbasert avlesning for proteinstabilitet, kombinert med en enkel protokoll for proteinekstraksjon for biokjemisk analyse, muliggjør hurtig identifisering av genetiske krav for proteinnedbrytning. Disse teknikkene kan bli tilpasset for å overvåke nedbrytningen av en rekke kortvarige proteiner. I det eksempel som presentert, HIS3 enzym, som er nødvendig for biosyntese histidin, ble smeltettil Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 er målrettet for degradering etter det abnormt engasjerer endoplasmatiske retikulum translocon. Celler som inneholder Deg1 -Sec62-HIS3 var i stand til å vokse under selektive betingelser når proteinet ble stabilisert.

Introduction

Selektiv protein degradering er avgjørende for eukaryote liv, og endret protein degradering bidrar til en rekke medisinske tilstander, inkludert flere typer kreft, nevrodegenerativ sykdom, hjerte- og karsykdommer, og cystisk fibrose 1-5. Ubiquitin-proteasom system (UPS), som katalyserer selektiv protein nedbrytning, er en voksende terapeutisk mål for disse forholdene 6-10. Ubiquitin ligaser kovalent feste polymerer av den 76-amino-syre ubiquitin til proteiner 11. Proteiner som er merket med polyubiquitin kjedene er anerkjent og proteolyserte av ~ 2,5 megadalton 26S proteasomet 12. Studier initiert i modellen eukaryot organisme Saccharomyces cerevisiae (spirende gjær) har vært grunnlegg i klarlegging av protein degraderingsmekanismer i eukaryote celler. Den første gang påvist fysiologiske substrat av UPS var gjær transkripsjonen repressor MATα2 13, 14, og mange høyt konserverte delene av UPS ble først identifisert og karakterisert i gjær (for eksempel 15 til 26). Funnene som er gjort i denne allsidige og genetisk medgjørlig modellorganisme vil trolig fortsette å gi viktig innsikt i konserverte mekanismer for ubiquitin-mediert degradering.

Anerkjennelse og degradering av de fleste UPS underlag krever felles handling av flere proteiner. Derfor er et viktig mål for å karakterisere den regulerte nedbrytning av en gitt ustabilt protein er å bestemme den genetiske krav for proteolyse. Klassiske metoder (f.eks puls-chase og cykloheksimid-chase eksperimenter 27) for overvåking av proteindegradering i pattedyr eller gjærceller er arbeidskrevende og tidkrevende. Mens disse typer av metodikk gir meget følsomme midler for påvisning av proteindegradering, er de ikke egnet til hurtig analyse av proteindegradering eller store maskeringsng for mutasjoner som hindrer protein degradering. Her er en gjærvekst-basert assay for rask identifisering av genetiske krav til nedbrytning av ustabile proteiner presentert.

I gjærvekst-basert metode for analyse av proteindegradering, et ustabilt protein av interesse (eller degradering signal) er sammensmeltet, i rammen, til et protein som er nødvendig for gjærvekst under visse omstendigheter. Resultatet er et kunstig substrat som kan tjene som et kraftig verktøy for å bestemme den genetiske krav protein nedbrytning av den ustabile proteinet av interesse. Hensiktsmessig mest brukte laboratoriegjærstammer huse et panel av mutasjoner i gener som koder for metabolske enzymer som er involvert i biosyntesen av bestemte aminosyrer eller nitrogenholdige baser (f.eks 20,28-30). Disse enzymene er viktig for cellulær proliferasjon i fravær av eksogent tilgjengelig metabolitter i hvis syntese enzymer deltar. Slikmetabolske enzymer kan således virke som vekstbaserte reportere for nedbrytning av ustabile proteiner til hvilke de er sammensmeltet. De genetiske krav for proteinnedbrytning lett kan belyst, siden mutasjoner som hindrer proteolyse vil tillate celler som inneholder nedbrytning reporter til å vokse under selektive betingelser.

En vekstfordel er en indirekte indikasjon på at en bestemt mutasjon øker overflod av proteinet av interesse. Imidlertid kreves direkte biokjemisk analyse for å bekrefte at en mutasjon tillater vekst gjennom økt proteinnivå heller enn via indirekte eller kunstig årsaker. Effekten av en mutasjon på protein overflod kan bli bekreftet ved western blot-analyse av steady-state-proteinnivåer i celler som ikke gjør det havnen den spesielle mutasjon. En fremgangsmåte for hurtig og effektiv ekstraksjon av gjærproteiner (sekvensiell inkubasjon av gjærceller med natriumhydroksyd og prøvebuffer) i en form som egner segfor analyse av western blotting er også presentert 31. Sammen utgjør disse eksperimentene lette rask identifisering av kandidat regulatorer av protein degradering.

Protocol

1. Gjær Vekst analysen å identifisere Kandidat Mutants Defekte i protein degradering Transform vill-type og mutante gjærceller med et plasmid som koder for et ustabilt protein fusjonert i ramme til en reporter metabolsk enzym. Inokulere transformanter i 5 ml syntetisk definert (SD) minimalt medium som er selektivt for celler som inneholder plasmid-molekyler. Inkuber over natten ved 30 ° C, roterer. Måle den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600) av hver kultur natten over. <…

Representative Results

For å illustrere denne metodikk, har HIS3 enzymet blitt smeltet til karboksy-terminus av modellen endoplasmatiske retikulum (ER) -associated nedbrytning (erad) substrat, Deg1 -Sec62 (figur 2A) til å lage Deg1 -Sec62-HIS3 (Figur 3) . Deg1 -Sec62 representerer en av grunnleggerne av en ny klasse av erad underlag som er målrettet etter vedvarende, avvikende tilknytning til translocon, kanalen primært ansvarlig for flytting av proteiner over ER membranen …

Discussion

Metodikken som presenteres her muliggjør rask bestemmelse og biokjemiske bekreftelse av genetiske krav for proteindegradering i gjærceller. Disse eksperimentene markere nytten og kraft gjær som modell eukaryot organisme (flere gode anmeldelser av gjær biologi og samlinger av protokoller for håndtering, oppbevaring og manipulerer gjærceller (f.eks 41-44) er tilgjengelig for etterforskerne nye til organismen). Teknikkene kan lett bli anvendt for å undersøke nedbrytning og overflod av en rekke f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker nåværende og tidligere medlemmer av Rubenstein lab for å gi en støttende og entusiastisk forskningsmiljø. Vi takker Ryan T. Gibson for å få hjelp i protokollen optimalisering. Vi takker Mark Hochstrasser (Yale University) og Dieter Wolf (Universität Stuttgart) for gjærstammer og plasmider. Vi takker våre anonyme lesere for deres hjelp i å forbedre klarhet og nytten av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en forskningspris fra Ball State University kapittel av Sigma Xi til SGW, en National Institutes of Health stipend (R15 GM111713) til EPJ, en Ball State University Aspire forskningspris til EPJ, og midler fra Ball State University Provost kontor og Institutt for biologi.

Materials

Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
Plate imaging system (e.g.
Gel Doc XR+ System)		 Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, S11 (2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Tags

Protein DegradationSaccharomyces CerevisiaeGrowth-based AssayReporter EnzymeDeg1-Sec62-His3 FusionGenetic RequirementsBiochemical ConfirmationProtein ExtractionWestern BlottingEndoplasmic Reticulum Translocon
check_url/52428?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image