JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Tillväxt baserade Bestämning och biokemisk Bekräftelse av genetiska Krav för proteinnedbrytning i<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Published: February 16, 2015
doi:
10.3791/52428
, , ,
1Department of Biology,Ball State University, 2Division of Nephrology,Cincinnati Children’s Hospital

Summary

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Abstract

Reglerad proteinnedbrytning är avgörande för praktiskt taget varje cellulär funktion. Mycket av vad som är känt om de molekylära mekanismer och genetiska krav för eukaryot proteinnedbrytning ursprungligen inrättades i Saccharomyces cerevisiae. Klassiska analyser av proteinnedbrytning har förlitat sig på biokemiska puls chase och cykloheximid-chase metoder. Medan dessa tekniker ger känsligt medel för observation proteinnedbrytning, de är arbetskrävande, tidskrävande, och låg genomströmning. Dessa metoder är inte mottagliga för snabb eller storskalig screening för mutationer som förhindrar proteinnedbrytning. Här används en jästtillväxt-baserad analys för enkel identifiering av genetiska krav för proteinnedbrytning beskrivits. I denna analys är en reporterenzym som krävs för tillväxt under specifika selektiva betingelser fuserad till en instabil protein. Celler som saknar den endogena reporterenzymet men uttrycker fusionsproteinet kan växa under selective förhållanden endast när fusionsproteinet är stabiliserade (dvs. när proteinnedbrytning äventyras). I tillväxtanalysen beskriven här, är serieutspädningar av vildtyp och mutanta jästceller som hyste en plasmid som kodar för ett fusionsprotein i fläckar på selektiva och icke-selektivt medium. Tillväxten under selektiva betingelser är förenlig med nedskrivnings nedbrytning av en given mutation. Ökad protein överflöd bör biokemiskt bekräftas. Ett förfarande för snabb extraktion av jästproteiner i en form lämplig för elektrofores och western blotting demonstreras också. En tillväxtbaserad utläsning för proteinstabilitet, kombinerat med ett enkelt protokoll för proteinutvinning för biokemisk analys, underlättar snabb identifiering av genetiska krav för proteinnedbrytning. Dessa tekniker kan anpassas för att övervaka nedbrytningen av en mångfald av kortlivade proteiner. I exemplet som presenteras, HIS3 enzymet, vilket krävs för histidin-biosyntes, fuseradestill Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 är riktad till nedbrytning efter det avvikande griper endoplasmanätet translocon. Celler som härbärgerar Deg1 -Sec62-His3 kunde växa under selektiva betingelser när proteinet stabiliserades.

Introduction

Selektiv proteinnedbrytning är viktigt för eukaryot liv, och förändrad proteinnedbrytning bidrar till ett antal medicinska tillstånd, inklusive flera typer av cancer, neurodegenerativa sjukdomar, hjärt- och kärlsjukdomar, och cystisk fibros 1-5. Ubiquitin-proteasomsystemet (UPS), som katalyserar selektiv proteinnedbrytning, är en framväxande terapeutiskt mål för dessa förhållanden 6-10. Ubikitin ligaser kovalent fästa polymerer av den 76-aminosyran ubiquitin till proteiner 11. Proteiner som har markerats med polyubiquitin kedjor erkänns och proteolyseras av ~ 2,5 megadalton 26S proteasom 12. Studier som inletts i modellen eukaryot organism Saccharomyces cerevisiae (spirande jäst) har varit grundläggande i belysning av proteinnedbrytningsmekanismer i eukaryota celler. Den första visade fysiologiska substrat av UPS var jästen transkriptionsrepressor MATα2 13, 14, och många högkonserverade komponenter i UPS först identifierades eller kännetecknas av jäst (t.ex. 15-26). Upptäckter som gjorts i denna mångsidiga och genetiskt foglig modellorganism kommer sannolikt att fortsätta att ge viktiga insikter i bevarade mekanismer ubiquitinmedierad nedbrytning.

Erkännande och nedbrytning av de flesta UPS substrat kräver gemensamma åtgärder av flera proteiner. Därför är ett viktigt mål vid karakterisering av reglerad nedbrytning av en given instabilt protein för att bestämma de genetiska kraven för proteolys. Klassiska metoder (t.ex. puls chase och cykloheximid-chase experiment 27) för övervakning proteinnedbrytning i däggdjurs eller jästceller är arbetskrävande och tidsödande. Medan dessa typer av metodik ger höggradigt känsliga medel för att detektera proteinnedbrytning, är de inte lämpliga för snabb analys av proteinnedbrytning eller storskalig screening för mutationer som förhindrar proteinnedbrytning. Här är en jästtillväxt baserad analys för snabb identifiering av genetiska krav för nedbrytning av instabila proteiner presenteras.

I jästtillväxt-baserad metod för att analysera proteinnedbrytning, ett instabilt protein av intresse (eller signalförsämring) är sammansmält i ram, till ett protein som erfordras för jästtillväxt under särskilda omständigheter. Resultatet är ett artificiellt substrat, som kan fungera som ett kraftfullt verktyg för att bestämma de genetiska kraven för proteinnedbrytning av den instabila proteinet av intresse. Lämpligen mest vanligen använda stammar laboratoriejäst hyser en panel av mutationer i gener som kodar metaboliska enzymer involverade i biosyntesen av särskilda aminosyror eller kvävehaltiga baser (t.ex. 20,28-30). Dessa enzymer är väsentliga för cellproliferation i frånvaro av exogent tillhandahålls metaboliter i vilkas syntes enzymerna deltar. Sådanmetaboliska enzymer kan därmed fungera som tillväxtbaserade reportrar för nedbrytning av instabila proteiner som de är smält. De genetiska kraven för proteinnedbrytning lätt kan belysas, eftersom mutationer som förhindrar proteolys tillåter celler hyser reportern nedbrytningen att växa under selektiva betingelser.

En tillväxtfördel är en indirekt indikation på att en särskild mutation ökar överflödet av proteinet av intresse. Dock är direkt biokemisk analys krävs för att bekräfta att en mutation tillåter tillväxt genom ökade proteinnivåer snarare än via indirekta eller artefaktuella orsaker. Effekten av en mutation på protein överflöd kan bekräftas genom western blot-analys av steady-state proteinnivåer i celler som gör och inte hyser den speciella mutationen. Ett förfarande för snabb och effektiv extraktion av jästproteiner (sekventiell inkubering av jästceller med natriumhydroxid och provbuffert) i en form som är lämpligför analys med western blotting presenteras också 31. Tillsammans utgör dessa experiment underlättar snabb identifiering av kandidat regulatorer av proteinnedbrytning.

Protocol

1. Jäst Tillväxtanalys att identifiera kandidat Mutants Defekta i proteinnedbrytning Omvandla vildtyp och mutanta jästceller med en plasmid som kodar ett instabilt protein fuserat, i ram, till en reporter metabolisk enzym. Inokulera transformanter i 5 ml syntetisk definierats (SD) minimalt medium som är selektiv för celler som härbärgerar plasmidmolekyler. Inkubera över natten vid 30 ° C, att rotera. Mät den optiska tätheten vid 600 nm (OD 600) hos varje övernattskul…

Representative Results

För att illustrera denna metod, har HIS3 enzymet smälts till karboxiänden av modellen endoplasmatiska retiklet (ER) -associated nedbrytning (ERAD) substrat, Deg1 -Sec62 (figur 2A) för att skapa Deg1 -Sec62-His3 (Figur 3) . Deg1 -Sec62 representerar en av grundarna av en ny klass av ERAD substrat som är riktade efter ihållande, avvikande association med translocon, kanalen i första hand ansvarar för att flytta proteiner över ER membranet 32-34.</s…

Discussion

Den metod som presenteras här möjliggör snabb bestämning och biokemisk bekräftelse av genetiska krav för proteinnedbrytning i jästceller. Dessa experiment belysa nyttan och kraften av jäst som modell eukaryot organism (flera utmärkta recensioner av jästbiologi och sammanställningar av protokoll för hantering, lagring och manipulera jästceller (t.ex. 41-44) är tillgängliga för utredarna nya för organismen). Teknikerna kan utan vidare tillämpas för att undersöka nedbrytningen och f?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar nuvarande och tidigare medlemmar av Rubenstein labbet för att tillhandahålla en stödjande och entusiastisk forskningsmiljö. Vi tackar Ryan T. Gibson för hjälp i protokolloptimering. Vi tackar Mark Hochstrasser (Yale University) och Dieter Wolf (Universität Stuttgart) för jäststammar och plasmider. Vi tackar våra anonyma granskare för deras hjälp med att förbättra tydligheten och nyttan av detta manuskript. Detta arbete stöddes av ett forsknings utmärkelse från kapitlet Ball State University of Sigma Xi till SGW, en National Institutes of Health bidrag (K15 GM111713) till EMR, en Ball State University ASPIRE forsknings utmärkelse till EMR, och medel från statliga universitet Ball Provost kansli och Biologiska institutionen.

Materials

Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
Plate imaging system (e.g.
Gel Doc XR+ System)		 Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, S11 (2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Tags

Protein DegradationSaccharomyces CerevisiaeGrowth-based AssayReporter EnzymeDeg1-Sec62-His3 FusionGenetic RequirementsBiochemical ConfirmationProtein ExtractionWestern BlottingEndoplasmic Reticulum Translocon
check_url/52428?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image