Un pez de amamantar Laboratorio Bioensayo para evaluar la actividad antidepredación de metabolitos secundarios de los tejidos de organismos marinos
Summary
Este bioensayo emplea un pez depredador modelo para evaluar la presencia de metabolitos de alimentación-disuasión a partir de extractos orgánicos de los tejidos de organismos marinos naturales en concentraciones utilizando una matriz de comida comparable nutricionalmente.
Abstract
Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.
Introduction
Ecología Química desarrolla a través de la colaboración de los químicos y los ecologistas. Mientras que la especialidad de la ecología química terrestre ha estado alrededor por algún tiempo, el de la ecología química marina es sólo unas pocas décadas, pero ha aportado importantes conocimientos sobre la estructura de la ecología y la comunidad evolutiva de los organismos marinos 1-8. Aprovechando las tecnologías emergentes de buceo y la espectroscopia de RMN, los químicos orgánicos generados rápidamente un gran número de publicaciones que describen nuevos metabolitos de invertebrados y algas marinas bentónicas en los años 1970 y 1980 9. Suponiendo que los metabolitos secundarios deben servir algún propósito, muchas de estas publicaciones atribuidas ecológicamente propiedades importantes a nuevos compuestos sin evidencia empírica. Casi al mismo tiempo, los ecologistas también se están aprovechando de la llegada de buceo y la descripción de la distribución y abundancia de animales bentónicos y plantas conocidas previamente froestoy métodos de muestreo relativamente ineficaces como el dragado. La asunción de estos investigadores era que nada sésiles y de cuerpo blando deben ser defendidos químicamente para evitar el consumo por los depredadores 10. En un esfuerzo por introducir el empirismo a lo que era el trabajo de otra manera descriptiva sobre la abundancia de especies, algunos ecologistas comenzaron extrapolando defensas químicas a partir de ensayos de toxicidad 11. La mayoría de los ensayos de toxicidad implicaron la exposición del pescado entero u otros organismos a las suspensiones acuosas de extractos orgánicos crudos de tejidos de invertebrados, con la posterior determinación de las concentraciones en masa seca de los extractos responsables de matar a la mitad de los organismos de ensayo. Sin embargo, los ensayos de toxicidad no emulan la manera en que los depredadores potenciales perciben presa en condiciones naturales, y estudios posteriores no han encontrado relación entre la toxicidad y la palatabilidad 12-13. Es sorprendente que las publicaciones en revistas de prestigio utilizan técnicas que tienen poca o ninguna ecological relevancia 14-15 y que estos estudios son aún ampliamente citados hoy. Es aún más alarmante observar que los estudios basados en datos de toxicidad se siguen publicando 16-18. El método de bioensayo descrito en este documento se elaboró a finales de 1980 para proporcionar un enfoque ecológicamente relevante para los ecologistas químicos marinos para evaluar las defensas químicas antidepredación. El método requiere un modelo depredador para muestrear un extracto orgánico crudo desde el organismo diana a una concentración natural en una matriz alimentaria nutricionalmente comparable, proporcionando datos palatabilidad que son ecológicamente más significativa que los datos de toxicidad.
El enfoque general a la evaluación de la actividad antidepredación de los tejidos de organismos marinos incluye cuatro criterios importantes: (1) un depredador generalista apropiado debe ser utilizado en ensayos de alimentación, (2) los metabolitos orgánicos de todas las polaridades deben ser exhaustiva extraído del tejido de la orientar organismo, (3) los metabolitos deben be mezclado en un alimento experimental nutricionalmente adecuada a la misma concentración volumétrica tal como se encuentra en el organismo a partir del cual fueron extraídos, y (4) el diseño experimental y enfoque estadístico deben proporcionar una métrica significativa para indicar mal sabor relativa.
El procedimiento descrito a continuación está diseñado específicamente para evaluar las defensas químicas antidepredación en los invertebrados marinos del Caribe. Empleamos el pez cabeza azul, Thalassoma bifasciatum, como un pez depredador modelo porque esta especie es común en los arrecifes de coral del Caribe y se sabe que degustar una amplia variedad de invertebrados bentónicos 19. Tejido del organismo diana se extrae primero, a continuación, se combina con una mezcla de alimentos, y, finalmente, se ofreció a los grupos de T. bifasciatum para observar si rechazan los alimentos tratados con extracto. Los datos de ensayo que utilizan este método han aportado importantes conocimientos sobre la química defensiva de los organismos marinos 12,20-21, lhistoria ife compensaciones 22-24 y ecología de comunidades 25-26.
Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento descrito en este documento proporciona un protocolo relativamente simple, de laboratorio ecológicamente relevante para la evaluación de las defensas químicas antidepredación en los organismos marinos. En este artículo revisamos los criterios importantes que son satisfechas por este conjunto de métodos:
(1) predador apropiado. Este ensayo de alimentación emplea el pez cabeza azul, Thalassoma bifasciatum, uno de los peces más abundantes en los arrecif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank James Maeda and Aaron Cooke for assistance with the filming and editing of this video. Funding was provided by the National Science Foundation (OCE-0550468, 1029515).
Materials
| Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-20 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A41220 | |
| Anhydrous Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Cryocool Heat Transfer Fluid | Fisher Scientific | 20-548-146 | For vacuum concentrator |
| Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity | MP Biomedicals | 154723 | |
| Squid mantle rings | N/A | N/A | Can be purchased at grocery store |
| Denatonium benzoate | Aldrich | D5765 | |
| 50 ml graduated centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | |
| Disposable Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Rubber bulbs for Pasteur pipets | Fisher Scientific | 03-448-24 | |
| Red bulbs for pellet delivery | Fisher Scientific | 03-448-27 | |
| 250 ml round-bottom flask | Fisher Scientific | 10-067E | |
| Scintillation vial adapter for rotavap | Fisher Scientific | K747130-1324 | |
| Weightboats | Fisher Scientific | 02-202B | |
| Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| 5 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-53 | |
| 10 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-54 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | S17302 |
References
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