فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em> الإشريكية القولونية</em
Summary
Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.
Abstract
We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.
Introduction
إدخال تكنولوجيات overexpression عزز إما الدراسات البيوكيميائية لل-نسخة منخفضة الانزيمات عدد والإنتاج الصناعي من البروتينات الصيدلانية الفعالة (مثل الأنسولين). منذ ظهور هذه التقنيات، وقد تم تحقيق تقدم كبير لزيادة الغلة ونوعية البروتينات المؤتلف. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير بدائية النواة 1،2 و حقيقية النواة 3 أنظمة overexpression على مر السنين، وتقديم بدائل مفيدة ل"حصان العمل" للتكنولوجيا الحيوية من البروتين، أي كولاي. على وجه الخصوص، وتوافر منصات بديلة لE. أدى القولونية إلى إنتاج الببتيدات المؤتلف أو البروتينات التي تحمل التعديلات بعد متعدية. ومع ذلك، فإنه يجب ذكره أن E. القولونية لا يزال يمثل كائن الاختيار لإنتاج البروتين المؤتلف. ويرجع ذلك إلى عدة عوامل، من بينها الأكثر صلة يمكن أن تكونتعتبر: أ) توافر عدد كبير من أنظمة overexpression (ناقلات التعبير وسلالات) لE. القولونية 1،2. ب) مرات الجيل القصير، وغلة الكتلة الحيوية العالية، من E. القولونية في مجموعة متنوعة من الوسائط الغنية والاصطناعية. ج) للتلاعب سطحي إما في الكيمياء الحيوية وعلى المستوى الجيني لهذه الكائنات الحية الدقيقة. د) عزل سلالات قادرة على إنتاج البروتينات السامة 4؛ ت) بناء سلالات تتميز تحريض متجانسة على مستوى السكان 5،6. وبالإضافة إلى ذلك، تبين في الآونة الأخيرة أن الأنظمة التعبير مناسبة للإنتاج في E. القولونية من البروتينات بعد translationally تعديل يمكن وضعها والتي شيدت 2.
في الوقت الحاضر، ويستخدم البروتين overexpression أساسا للحصول على البروتينات أحادى أو وطي بلازميدة قليلة القسيمات، الذي لا يمكن أن يؤديها مع جين واحد مستنسخ إلى البلازميد المناسب hypersynthesis. ومع ذلك، كان الاهتمام في الآونة الأخيرةالمدفوعة لبناء E. أنظمة البروتين شاركت في التعبير القولونية، مما يشكل تحديا للإنتاج، في الجسم الحي، من مجمعات للمغاير بلازميدة قليلة القسيمات 2. ومن المثير للاهتمام، والتجارب في وقت مبكر من البروتين شاركت في التعبير كلمة أمام الجمعية بين الأنواع من مفارز كبيرة وصغيرة من كربوكسيلاز السيانوبكتيريا ريبولوز-1،5-bisphosphate / أوكسيجيناز 7،8، ورابطة أشكال اقتطاع وطول كامل من HIV-1 الناسخ 9 عكس. وأظهرت هذه الدراسات الرائدة التي البروتين شاركت في التعبير يمثل بديلا قويا لالتقليدية في إعادة المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، والبروتين شارك في التعبير في E. وقد استخدم القولونية لإنتاج البروتينات المختلفة التي تحمل التعديلات بعد متعدية 2، للحصول على البروتينات التي تحتوي على الأحماض الأمينية غير طبيعية 2، وزيادة العائد من بروتينات الغشاء overexpressed 2. وعلاوة على ذلك، فإن احتمال من البروتين شاركت في التعبير كأداة لتمنح لE. القولونية المنافسةالامتحانات التنافسية الوطنية في إفراز البروتين هو قيد التحقيق النشط 2.
اثنين من الاستراتيجيات الرئيسية للبروتين شارك في التعبير في E. القولونية يمكن اتباعها: ط) استخدام البلازميد واحد لاستضافة جينات مختلفة إلى أن overexpressed. ب) استخدام البلازميدات متعددة في الخلايا واحد للمشاركة في التعبير عن البروتينات المستهدفة. في الحالة الأولى، ومعايير لاختيار البلازميد لا تختلف عن تلك التي واحدة من التجارب البروتين overexpression التقليدية، على الرغم من البلازميدات معينة تحتوي على العناصر جنبا إلى جنب المروج / المشغل شيدت للمشاركة في التعبير 10. ولذا فإن هذا النهج الأول هو بسيط جدا. ومع ذلك، فإنه تجدر الإشارة إلى أن استخدام البلازميد واحد للمشاركة في التعبير عن مختلف البروتينات يواجه صعوبات كبيرة اثنين: أ) الكتلة الجزيئية للزيادات ناقلات مع عدد من الجينات استضافت، مما يحد من عدد من البروتينات وأعرب المشترك؛ ب) عندما يتم استنساخ جينات متعددة تحت سيطرة أحد المروجين واحد، يمكن قطبية decreasالبريد التعبير عن الجينات البعيدة من المروج. استخدام البلازميدات مزدوجة أو متعددة في واحد E. خلايا القولونية ديها لتحقيق التوافق بين ناقلات الاختيار، وبالتالي فرض القيود على تركيبات المؤهلة من البلازميدات. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية شاركت في التعبير الثانية يتميز بميزة التي تحتوي على الكتلة الجزيئية للناقلات، ويحد قطبية. نحن شيدت مؤخرا نظام المشاركة في التعبير البروتين مصممة لتسهيل مكوكية من الجينات بين البلازميدات شاركت في التعبير 11. على وجه الخصوص، ونحن شيدت سلسلة نواقل pGOOD، الميزات ذات الصلة والتي هي: أ) أصل p15A النسخ المتماثل، لتوفير التوافق من البلازميدات pGOOD مع ناقلات التجارية التي تحتوي على أصل ColE1 (على سبيل المثال، سلسلة pBAD 12)؛ ب) الكاسيت التتراسيكلين المقاومة. ج) وجود لاك -derived العناصر التنظيمية، أي المروج-المشغل (O 1) الزوجين واسي </eم> س الجين. باستخدام زوجين pBAD-pGOOD المناسب، كنا قادرين على بإفراط عن جوهر الحفاز E. القولونية DNA بوليميريز الثالث، تتكون من ثلاثة مفارز مختلفة، أي α (في 'البلمرة، ε (و3'-5 5'-3) "نوكلياز خارجية) وθ (استقرار ε) 13. على وجه الخصوص، أثبتنا أن شارك في التعبير عن مجمع αεθ كان يعتمد بشكل صارم على بالإضافة إلى E. القولونية مستنبت كل من IPTG وأرابينوز، مما اثار overexpression من pGOOD وpBAD، على التوالي (الشكل 1A).
في هذا التقرير، فإننا توضيح كيفية البروتين شاركت في التعبير يمكن أن تحل بكفاءة صعوبات مرتبطة الذوبان الفقراء من حدة فرعية البروتين المعقدة. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيف في بروتين الجسم الحي الاختبارات تكامل لا يمكن أن يؤديها، ونحن تقريرا أخيرا على استخدام البروتين شاركت في التعبير للتردد طفرة في تناغم E. مضيق بين قمتينأنا. لتحقيق هذا الهدف، وكنا الأزواج pGOOD-pBAD مناسبة لتوضيح الأمثلة ذات الصلة في كل دراسة حالة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن تكون البروتينات المختلين جوهريا، ويضم المناطق التي لا تقتصر على عدد محدود من التشكل 25 الهيكل العالي. هذه البروتينات المختلين وعادة ما تكون عرضة لتجميع 25، وعزلتهم وتوصيف قد تمثل مهمة صعبة. الوحيدات ε من E. القولونية DNA بوليميريز III ملامح اثنين م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
واعترف بشكل كبير على إذن من الوثاب وإلسفير في إعادة طبع الأرقام.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
- Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
- Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
- Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
- Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
- Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
- Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
- Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
- Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
- Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
- Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
- DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
- Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
- Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
- Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
- Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
- Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
- Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, (2008).
- Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
- Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
- Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
- Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
- Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E., McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).
