Det mangefasetterte Fordeler med Protein Co-uttrykk i<em> Escherichia coli</em

Summary

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Abstract

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduction

Innføringen av overekspresjon teknologier styrket enten biokjemiske studier av lavt kopitall enzymer og industriell fremstilling av farmakologisk aktive proteiner (for eksempel insulin). Siden advent av disse teknologiene, har betydelige fremskritt er oppnådd å øke utbyttet og kvaliteten av rekombinante proteiner. I tillegg ble ^1,2 prokaryote og eukaryote ³ høyekspresjonsystemer utviklet seg gjennom årene, som tilbyr nyttige alternativer til "arbeids hest" av protein bioteknologi, dvs. Escherichia coli. Spesielt tilgjengeligheten av alternative plattformer til E. coli førte til produksjon av rekombinante peptider eller proteiner som bærer post-translasjonelle modifikasjoner. Det bør imidlertid nevnes at E. coli representerer fortsatt organismen av valget for rekombinant proteinproduksjon. Dette er på grunn av flere faktorer, blant hvilke den mest relevante kan blibetraktet: i) tilgjengeligheten av ganske mange høyekspresjonsystemer (ekspresjons vektorer og stammer) for E. coli ^1,2; ii) den korte generasjonstid, og høy biomasse gir, av E. coli i en rekke rik og syntetiske media; iii) den lette manipulering enten på biokjemiske og på genetisk nivå av denne mikroorganisme; iv) isolering av stammer som er i stand til produksjon av toksiske proteiner ^4; v) bygging av stammer med homogen induksjon på befolkningsnivå ^5,6. I tillegg ble det nylig vist at ekspresjon systemer som er egnet for produksjon i E. coli av etter translasjonelt modifiserte proteiner kan være utformet og konstruert ^to.

For tiden blir protein overekspresjon i hovedsak brukt for å oppnå monomere eller homo-oligomere proteiner, hvis hypersynthesis kan utføres med et enkelt gen klonet inn i en passende plasmid. Men oppmerksomhet var nyligutbetalt til bygging av E. coli-protein co-ekspresjonssystemer, utfordrende fremstilling, in vivo, av hetero-oligomere komplekser ^2. Interessant, tidlige eksperimenter av protein co-uttrykk adressert inter-arter montering av store og små subenheter av cyanobacterial ribulose-1,5-bisfosfat karboksylase / oksygenase ^7,8, og foreningen av avkortede og full-lengde former av HIV-1 revers transkriptase ^9. Disse banebrytende studier viste at protein co-uttrykk representerer et kraftig alternativ til tradisjonell in vitro tilberedning. I tillegg protein ko-ekspresjon i E. coli ble brukt til å fremstille forskjellige proteiner som bærer post-translasjonelle modifikasjoner ^2, for å oppnå proteiner som inneholder unaturlige aminosyrer ^2, og for å øke utbyttet av overuttrykte membranproteiner ^2. Videre til potensialet i protein co-uttrykk som et verktøy konferere til E. coli konkurrereNCE i protein sekresjon er under aktiv etterforskning ^to.

To hovedstrategier protein co-uttrykk i E. coli kan bli fulgt: i) bruk av et enkelt plasmid for å være vert for forskjellige gener som skal overuttrykt; ii) bruk av flere plasmider i enkeltceller til å ko-uttrykke de aktuelle proteinene. I det første tilfellet, må kriteriene for valg av plasmid ikke skiller seg fra tradisjonelle enkelt protein høyekspresjonsystemer eksperimenter, selv om bestemte plasmider inneholder tandem promoter / operatør elementer ble konstruert for co-uttrykk ^10. Denne første metode er derfor ganske enkel. Imidlertid bør det nevnes at bruken av en enkelt plasmid med ko-uttrykke forskjellige proteiner står overfor to hovedproblemer: i) molekylvekt på vektor øker med antallet av verts gener, noe som begrenser antallet av co-uttrykte proteiner; ii) når flere gener er klonet under kontroll av en enkelt promotor, polaritet kan minske ekspresjonen av genene distale fra promotoren. Bruken av doble eller multiple-plasmidene i enkelt E. coli-celler har for å oppnå kompatibilitet av vektorene valg, derfor innføre begrensninger for de kvalifiserte kombinasjoner av plasmider. Men denne andre ko-ekspresjon strategi har den fordel inneholder den molekylære massen av vektorer, og begrenser polaritet. Vi har nylig bygget et protein co-uttrykk system designet for å forenkle skyt av gener mellom co-ekspresjonsplasmidene ^11. Spesielt konstruerte vi pGOOD vektorer serie, de relevante egenskaper av disse er: i) en p15A replikasjonsorigo, for å være kompatibel med de pGOOD plasmider med de kommersielle vektorer inneholdende den ColE1 opprinnelse (f.eks pBAD-serien ^12); ii) en tetracyklin-resistens kassett; iii) tilstedeværelse av lac-avledede regulatoriske elementer, dvs. arrangøren-Operatør (O ₁₎ par og lacl </em> ^q genet. Ved hjelp av en passende pBAD-pGOOD par, var vi i stand til å overuttrykker den katalytiske kjerne av E. coli DNA-polymerase III, som består av tre forskjellige underenheter, dvs. α (5'-3 'polymerase), ε (3'-5' eksonuklease) og θ (stabiliserende ε) ^13. I særdeleshet har vi demonstrert at ko-ekspresjon av αεθ komplekset var strengt avhengig tillegg til E. coli dyrkingsmedium for både IPTG og arabinose, utløser overekspresjon fra pGOOD og pBAD, henholdsvis (figur 1A).

I den foreliggende rapporten, vi illustrere hvordan protein co-uttrykk kan effektivt løse problemer knyttet til de fattige løseligheten av et proteinkompleks subenhet. I tillegg viser vi hvordan in vivo protein komplemente testene kan utføres, og vi endelig rapportere om bruken av protein co-uttrykk for å tune mutasjonsfrekvensen i E. coli. Til dette målet, brukte vi pGOOD-pBAD par passende å illustrere relevante eksempler på hver case study.

Protocol

1. Isolering av E. coli Co-transformanter Forbered elektro kompetente celler av den aktuelle E. coli-stamme som skal transformeres. Overføring til 1 ml LB-medium (Trypton, gjærekstrakt, NaCl ved 10, 5 og 10 g / l, henholdsvis) en enkelt koloni av stammen av valget, og inkuber ved 37 ° C under risting forhold på 180 rpm. Fortynn pre-kulturen 1: 500 i 25 ml frisk LB-medium og inkuberes kulturen ved 37 ° C. Ved log-fase (0,6 OD) Sentrifuger cellene suspensjonen ved 5000 xg i 20 m…

Representative Results

Den ε subenhet av E. coli DNA polymerase III består av 243 aminosyrer og har dårlig oppløselighet 17,18, hvis restene 187-243 slettes 17. Imidlertid har vi tidligere vist 11 at co-uttrykk for helaftens α, ε, og θ subenheter gir løselig DNA polymerase III katalytisk kjerne (figur 1). Spesielt ved bruk av pBAD-pGOOD co-ekspresjonssystem, demonstrerte vi at: i) kan overekspresjon av α og ε subenheter være uavhengig styrt av arabinose og IPTG, henholdsvis…

Discussion

Proteiner kan være egentlig uordnede, med regioner som tertiær struktur er ikke begrenset til et begrenset antall conformations ^25. Disse uordnede proteiner er vanligvis utsatt for aggregering ^25, og deres isolering og karakterisering kan representere en vanskelig oppgave. Den ε subenhet av E. coli DNA polymerase III har to distinkte domener ^26,27, nemlig: i) N-ter domene, som bærer 3'-5 'eksonukleaseaktivitet og vedkommende i bindingen av θ subenhet; ii) C-ter dome…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix