マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響クリプトコックス·ネオフォルマンス

Summary

この記事では、マクロファージをCryptococcus neoformansに感染させるためのプロトコルについて説明します。また、マクロファージからのステロールの枯渇方法についても説明します。これらのプロトコルは、in vitroで真菌感染症を研究し、そのような感染症におけるステロールの役割を調べるためのガイドを提供します。

Abstract

クリプトコッカス属、クリプトコッカスの病原性真菌によって引き起こされる生命を脅かす感染症である。感染は、肺深部に複製することができる胞子の吸入時に起こる。マクロファージによるクリプトコッカスの食作用は、疾患が致死髄膜脳炎を引き起こす中枢神経系に拡散することができる方法の一つである。したがって、 クリプトコッカスおよびマクロファージとの間の関連の研究では、感染の進行を理解する上で重要である。本研究ではCでマクロファージ感染性を研究するためのステップバイステップのプロトコルについて説明in vitroでのネオフォルマンス 。このプロトコルを使用して、宿主 - 病原体相互作用のホストステロールの役割が検討されている。メチルの異なる濃度 - シクロデキストリン（MCD）は、マウス細網肉腫マクロファージ様細胞株J774A.1からコレステロールを枯渇させるために使用された。コレステロール枯渇を確認し、商業的にご利用でき、両方を用いて定量した電子コレステロール定量キット、薄層クロマトグラフィー。コレステロール枯渇細胞は、リポ多糖（LPS）およびインターフェロンγ（IFNγ）を使用して活性化し、1のエフェクター対標的比での抗体-オプソニンクリプトコックス·ネオフォルマンス 、野生型H99細胞を感染させた：1。感染細胞をC.とのインキュベーションの2時間後にモニターしたネオフォルマンスおよびそれらの食作用指数を算出した。コレステロール枯渇は、食作用指数の有意な減少をもたらした。提示されたプロトコルは、実験室環境での感染過程の開始を模倣し、感染性に対するホスト脂質組成の役割を研究するための便利な方法を提供する。

Introduction

食作用は、細胞外のエンティティは、宿主細胞によって内在化されるプロセスである。これは、病原体に対して防御する免疫系の武器庫で重要な武器ですが、プロセスは、多くの場合、内在化および体¹全体に拡散を可能にするために、病原体によって打倒することもできる。食作用は、宿主細胞の細胞骨格の再編成を経由して添付ファイルや飲み込みにつながるいくつかのシグナル伝達事象によって媒介される。 「プロフェッショナル」食細胞が病原体を巻き込むとファゴソーム^2を形成し、添付ファイルや葉状仮足の形成のために知らせるために侵入病原体の表面にオプソニンを認識して結合することができる。いわゆる「プロ」食細胞の中では、マクロファージである。マクロファージは、ほとんどの、探し出しおよび疾患を引き起こす物質を排除し、損傷組織を修復し、炎症を媒介含む保護機能を遂行高度に特殊化した細胞である食作用^1,2のプロセスを介してこれらの。

クリプトコックス·ネオフォルマンスクリプトコッカスとして知られている重大な疾患を引き起こす病原性酵母の種である。 クリプトコッカス胞子はホストによって吸入され、通常は無症候性である肺感染症につながるされている。これは、露光が極めて一般的であると考えられている。ブロンクス·レバノン病院センターの小児伝染病から61子どものサンプルクリニックは^、非感染し、感染大人^3....

Protocol

MβCDとJ774A.1細胞の1コレステロール枯渇

1. 無菌の生物学的安全キャビネット内で、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 ⁵ J774A.1マクロファージ様細胞を播種ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）。 37℃でインキュベートし、5％CO ₂ O / N。
2. 細胞単層から培地を除去し、ろ過またはオートクレーブ処理された1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄。
3. コントロールとして、所望の濃度（10 mM以下PBS中30 mM）のまたは1x PBSでMβCD溶液200μlを加え、振とうしながら37℃で30分間インキュベートする。手順の直後に市販のキットを用いて定量分析をRTで上清と予備を削除します。
4. 1X PBSまたは無血清DMEMで細胞を2〜3回洗浄しpipettiによる感染または溶解細胞を続行薄層クロマトグラフィーまたはキットを用いた分析のために、脱イオンH ₂ Oで2〜3回ngの。
   注：以下はコレステロール枯渇市販のコレステロール定量キットを使用することができる。詳細については、資料のセクションを参照してください。書かれたように、メーカーの指示に従ってください。

薄層クロマトグラフィー....

Results

コレステロール枯渇

1×PBS対照と比較してアンプレックスレッドコレステロールアッセイキットで、製造業者の指示に従って、プロトコルのステップ1.3で予約された上清の分析は、MβCD処理された試料中のコレステロール濃度の上昇をもたらす。細胞型およびMβCD濃度使用コレステロール枯渇に応じて変化してもよい。 10mMのMβCDで処理J774は、約50％の枯渇が観察された。枯渇は、ステップ1.4で回収した上清および細胞溶解物（ 図1）から得られた値を用いて算出することができる。

TLCを用いて解析し、細胞溶解物は、MβCD（ 図2A）の濃度を増加させることで処理した細胞におけるコレステロールの染色の顕著な減少を示す。 TLCのデンシトメトリー分析は、定量的アッセイ（ 図2B）と同様の傾向を示している。ブライ·ダイアーの方法は、粗製EXTを与えます総脂質のRACT、それがコレステロールの標準を利用して適切なバンドを同定するために、脂質の適.......

Discussion

哺乳動物細胞をプレーティングし、C.オプソニン化するとき、このプロトコルでの作業では、正確な細胞数を得ることが重要であるネオフォルマンス細胞 。これは試行間の変動を最小限に抑え、正確な1を確実に：研究を通してエフェクター比に1ターゲットを。これは、手順の間にRTで休んでオプソニン化酵母細胞または処理されたマクロファージ細胞を防ぐために、コレステロール枯渇および感染のタイミングを調整することも重要である。感染を開始する前に、長い待機期間は、抗体オプソニンの損失または枯渇コレステロールの補充につながる可能性があります。実験精度で行われた場合の結論は、食作用におけるコレステロールの役割について識別するためのデータ分析を可能にする。

技術の限界は、コレステロール枯渇は、細胞のようなマクロファージの食作用指数を低下させることによって、特定のメカニズムに関していかなる結論を防ぎ、そしてそれはefのかどうかは不明であるfectが原因コレステロールや、二次メカニズムに直接です。この静脈に沿ってさらに作業は、そのようなFcγ受容体などの食作用において機能することが.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
クラスIIタイプA2バイオセーフティキャビネット	Labconco	3460009
J774A.1細胞株	ATCC	TIB-67	冷凍入荷。ATCCの培養方法を参照してください。
ダルベッコS Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	4 °Cで37°Cまで暖かい。HI
の胎児のウシの血清のパフォーマンス プラス	Gibco	10082-147	-20度で凍結して保つ;DMEM
ニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)	Gibco	15140-122	DMEM
Isotemp細胞培養インキュベーター	Fisher Scientific		Model # 3530
96ウェル培養皿	Corning Inc. Costar	3595
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	1倍に希釈し、使用前にろ過またはオートクレーブします。
メチル-β;-シクロデキストリン	シグマライフサイエンス	C4555-10G	1x PBSに溶解して、10 mMおよび30 mMの濃度の溶液を作製
オービタルシェーカー	Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Life Technologies Molecular Probes	A12216	コレステロールアッセイ用のすべての試薬はキットに含まれています。製造元の指示に従ってください。
96ウェル ブラックアッセイプレート	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax マイクロプレートリーダー	Molecular Devices		モデル F5
TLC チャンバー	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
クロロホルム	Sigma-Aldrich	650498-4L
メタノール	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC ペーパー	Whatman	3030917	TLCタンクに必要なサイズに縮小
フード			AIHA/ANSI規格に準拠した任意のヒュームフード
6ウェルプレート	コーニング社 Costar	3506
トリプシンEDTA	Gibco	25300-054
セルスクレーパー	Corning Inc. Costar	3010
血球計算盤	Hausser Scientific	1490
遠心分離機	ベックマン・コールター		モデル アレグラ x-30R
Votexミキサー	フィッシャー・サイエンティフィック	12-812
バランス	メトラー・トレド		モデル#MS104S meaures 0.1 mg
ガラスパスツールピペット	フィッシャーブランド	13-678-20A
コレステロール	アバンティ 極性脂質	700000
SpeedVac濃縮器	Thermo Scientific		Model # SPD2010
石油エーテル	Fisher Scientific	E139-1
ジエチルエーテル	Sigma-Aldrich	309966
酢酸	Sigma-Aldrich	320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone	Analytical Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
ヨウ素チップ	Sigma-Aldrich	376558-50G
硫酸	Sigma-Aldrich	320501
塩化マンガン	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging System	Ultra-Violet Products Ltd.		デンシトメトリー分析にVision Works LSソフトウェアを使用する
ガラス底共焦点皿	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			デューク大学医療センターYNB
	BD	239210	準備手順については、メーカーを参照してください。グルコース濃度は20 g / Lを使用してください。
リポ多糖	類Sigma	L4391-1MG	1x PBSに溶解して、1 mg / mlストックを作成します。-20°Cで保管してください。
インターフェロンガンマ	シグマ	I4777は	、0.1 mg / mlのストック溶液を作るために1x PBSに溶解
クロノキシロマンナン抗体(抗GXM)			Arturo Casadevallの研究室からの贈り物 濃度は1.98 mg / ml
です Giemsa	MP Biomedicals	194591	0.8 gのギムサを25 mlのグリセロールに溶解し、60 °Cに加熱します。Cを1時間。溶液に25mlのメタノールを加え、室温で少なくとも1ヶ月間熟成させます。
顕微鏡	Zeiss		Observer.D1 顕微鏡 with AxioCam MRm for taking images