Murine Isoleret Heart Model af Myokardie Bedøvelse associeret med cardioplegisk Arrest

Summary

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Abstract

Følgende protokol er brug for at evaluere nedsat hjertefunktion eller myokardielammelse følgende moderate iskæmiske fornærmelser. Teknikken er nyttig til modellering iskæmisk skade i forbindelse med talrige klinisk relevant fænomen herunder hjertekirurgi med cardioplegisk arrestation og kardiopulmonal bypass, off-pumpe CABG, transplantation, angina, korte iskæmi, osv. Protokollen indeholder en generel metode til at modellere hypotermisk hyperkalemic cardioplegisk anholdelse og reperfusion i gnavere hjerter med fokus på måling af myocardial kontraktile funktion. Kort fortalt er en mus hjerte perfunderet i Langendorff tilstand, instrumenteret med en intraventrikulære ballon, og baseline kardiale funktionelle parametre registreres. Efter stabilisering, hjertet er så underlagt orientere infusion af en hjertebeskyttende hypotermisk kardioplegi løsning til at indlede diastoliske anholdelse. Kardioplegi leveres med mellemrum i løbet af 2 timer. Hjertet bliver derefter reperfunderes og Warmed til normotermiske temperaturer og genvinding af myokardie funktion overvåges. Brug af denne protokol resulterer i pålidelige deprimeret hjertefunktion kontraktile funktion fri fra brutto myocardial vævsskader hos gnavere.

Introduction

Myokardielammelse defineres som reversibel nedsat kontraktile aktivitet trods restaurering af tilstrækkelig blodgennemstrømning efter en kort periode med iskæmi eller længere perioder af iskæmiske fornærmelser med kardiobeskyttelse ^1,2,3,4,5. Den præsenterede metode anvendes til at modellere klinisk relevante iskæmiske fornærmelser som kan resultere i reversibel svækkelser i kontraktil funktion (dvs. iskæmiske fornærmelser forbundet med hjertekirurgi udnytte kardioplegisk standsning, korte perioder med iskæmi, angina, etc.). I modsætning til alvorlige iskæmi undersøgelser (myokardieinfarkt, nekrose) Denne protokol blev udviklet til evaluering myokardie funktionel genopretning og kardiobeskyttelse uden vævsskade, remodeling, og celledød. Størstedelen af ​​artikel diskuterer en standard cardioplegisk anholdelse protokol med elementer svarende til en hjerteoperation hjælp hypotermi og intermitterende kardioplegi levering.

Myocardial protfdeling under størstedelen af ​​hjertekirurgi afhængig kardioplegi og kardiopulmonal bypass. Selvom kardioplegi (CP) løsninger og strategier varierer meget (blod, krystalloid, kulde, varme etc.) de mest almindelige elementer er 1) hyperkaliæmi og / eller andre strategier for at anholde hjertet i diastole, hvilket begrænser energiudnyttelse følge af myokardie sammentrækning, og 2) hypotermi til langsom metabolisme og hjælpe med at opretholde ATP og andre energireserver mens arresteret. Aktuelle kardioplegi løsninger giver beskyttelse til hjertet mod iskæmiske fornærmelser, der ellers ville vise sig letal. Imidlertid hjertebeskyttende strategier under kirurgisk iskæmiske fornærmelser er ikke perfekte, og den resulterende mild iskæmisk skade kan resultere i reversibel kardial kontraktil dysfunktion trods tilstrækkelig blodgennemstrømning (myokardielammelse), acidose, cardiomyocythypertrofi skader, og vaskulære virkninger, herunder reduceret koronar perfusion og vasospasme.

Denne protokol adskillerfra standard isolerede hjerte iskæmimodeller evaluering myokardieinfarkt og alvorlig iskæmi, idet den vurderer mildere iskæmiske fornærmelser, som kan resultere i nedsat hjertefunktion følgende korte iskæmi eller iskæmiske fornærmelser forbundet med cardioplegisk anholdelse. (Til gennemgang på Langendorff perfusion teknikker og I / R undersøgelser se ^{6 – 8).} For generelle retningslinjer og en grundig analyse af eksperimentelle parametre forbundet med musen isolerede perfunderede hjerter se Sutherland e t al. 2003 ⁹ Teknikken præsenteres her beskriver den nødvendige udstyr, reagenser, trin, strategier og tips til pålideligt fremkalde bedøvelse i mus hjerter. Mindre ændringer er nødvendige for at anvende teknikken til rotter.

Kort fortalt isoleret muse hjerter Langendorff perfunderes i ca. 30 min med fysiologisk Krebs-Henseleit puffer (KHB) efterfulgt af koldt beskyttet hjertestop via levering af et hyperkalemic hypothermic kardioplegi opløsning. Efter anholdelse, er hjerte-funktionel genopretning overvåges under genopvarmning og reperfusion af hjertet med KHB. Ændringer i graden af ​​genvinding af hjertefunktion kontraktile funktion kan evalueres for at vurdere cardioprotektive agenter og forskellige hjertebeskyttelsesassays strategier.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer blev godkendt af Levetid Institutional Animal Care og brug Udvalg og alle dyr og procedurer i henhold til National Research Council Guide for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr 10. 1. Ballon Fabrikation og venstre ventrikel tryk Overvågning Circuit Konstruere LV balloner ifølge Miller et al. 11 I et bægerglas med en omrører, blandes 9,5 ml destilleret vand, 14,2 ml af lys majssirup og 33,8 g saccharose, og der opvarmes p?…

Representative Results

Figur 1 viser typiske resultater fra en mus eksperiment. LVP (rød linje), blev dP / dt (grøn linje), og temperatur (lilla linje) continusouly optaget over ~ 3 timer. Bogstaver angiver en – baseline måling, b, c, d, e – levering af kardioplegi løsning, f – start på reperfusion, g, h, i, j – måling af cornary flow under reperfusion. Bemærk, deprimeret LVDP og dP / dt ved reperfusion sammenlignet med baseline. Figur 1B omfatter data fra en optaget over ~ 2 sek. Bemærk, faldet i LVP…

Discussion

De foregående protokol detaljer metoder til at evaluere myokardielammelse sekundært til global iskæmi forbundet med cardioplegisk anholdelse. I vore hænder denne protokol giver en omtrentlig ~ reduktion i hjertefunktion 40% (LVDP, +/- dP / dt) med minimale ændringer i hjertefrekvensen på 30 minutter efter reperfusion tidspunkt. Som hjertet er reperfusionerede og rewarmed alle parametre for hjertefunktion reduceres ved initiale tidspunkter med et stærkt reduceret hjertefrekvens før stabilisering mellem 20 og 30 m…

Materials

Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters – 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures