Muse Isolert Hjerte Modell av hjerteinfarkt Stunning Associated med kardioplegiske Arrest

Summary

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Abstract

Følgende protokoll er til nytte for å vurdere nedsatt hjertefunksjon eller hjerteinfarkt fantastisk følgende moderate iskemiske fornærmelser. Teknikken er nyttig for modellering iskemisk skade i forbindelse med en rekke klinisk relevant fenomen inkludert hjertekirurgi med kardioplegiske arrest og hjerte-bypass, off-pumpe CABG, transplantasjon, angina, kort iskemi, etc. Protokollen presenterer en generell metode for å modellere hypotermisk hyperkalemic kardioplegiske arrest og reperfusjon i gnager hjerter med fokus på måling av hjerteinfarkt kontraktile funksjon. I korte trekk, er en mus hjerte perfusert i Langendorff modus, instrumentert med et intraventrikulært ballong, og baseline hjerte funksjonelle parametre er registrert. Etter stabilisering, er hjertet så lagt orientere infusjon av en kardio hypotermisk kardioplegi løsning for å initiere diastolisk arrest. Kardioplegi leveres periodisk i løpet av 2 timer. Hjertet blir så reperfunderes og warmed å normotermisk temperaturer og utvinning av myokardfunksjon overvåkes. Bruk av denne protokollen resulterer i pålitelig deprimert hjerte kontraktile funksjon fri fra brutto hjerteinfarkt vevsskade hos gnagere.

Introduction

Hjerteinfarkt imponerende er definert som reversible redusert kontraktile aktivitet til tross for restaurering av tilstrekkelig blodstrømmen etter en kort periode med iskemi eller lengre perioder iskemiske fornærmelser med kardio ^1,2,3,4,5. Metoden som presenteres er spesielt brukt til å modellere klinisk relevante iskemiske fornærmelser som kan resultere i reversible svekkelser i kontraktile funksjon (dvs. iskemiske fornærmelser forbundet med hjertekirurgi utnytte kardioplegiske arrest, korte perioder med iskemi, angina, etc.). I motsetning til alvorlig iskemi studier (hjerteinfarkt, nekrose) denne protokollen ble utviklet for å evaluere myocardial funksjonell bedring og kardio uten vevsskade, ombygging, og celledød. Flertallet av papiret diskuterer en standard kardioplegiske arrest protokoll med elementer som ligner på en hjertekirurgi ved hjelp hypotermi og periodisk kardioplegi levering.

Hjerteinfarkt protection under mesteparten av hjertekirurgi er avhengig kardioplegi og hjerte-bypass. Selv kardioplegi (CP) løsninger og strategier varierer mye (blod, krystalloid, kulde, varme etc.) de felles elementer 1) hyperkalemi og / eller andre strategier for å stanse hjertet i diastole og dermed begrense energiutnyttelse som følge av myokardial sammentrekning, og 2) hypotermi å bremse stoffskiftet og hjelpe opprettholde ATP og andre energireserver mens arrestert. Nåværende kardioplegi løsninger gir beskyttelse til hjertet mot iskemiske fornærmelser som ellers ville bevise dødelige. Men kardio strategier under kirurgiske iskemiske fornærmelser er ikke perfekt, og den resulterende mild iskemisk skade kan føre til reversible hjerte kontraktile dysfunksjon tross tilstrekkelig blodstrøm (myocardial imponerende), acidose, cardiomyocyte skade, og vaskulære effekter inkludert redusert koronar perfusjon og vasospasme.

Denne protokollen er forskjelligfra standard isolerte hjertet ischemi modeller evaluere myokardinfarkt og alvorlig ischemia ved at den evaluerer mildere iskemiske fornærmelser noe som kan resultere i nedsatt hjertefunksjon etter iskemi kort eller ischemiske fornærmelser forbundet med kardioplegiske arrest. (For gjennomgang på Langendorff perfusjon teknikker og I / R studier se ^{6 – 8).} For generelle retningslinjer og en grundig analyse av eksperimentelle parametre assosiert med muse isolerte perfuserte hjerter se Sutherland e t al. 2003 ⁹ Teknikken som presenteres her beskriver nødvendig utstyr, reagenser, trinn, strategier og tips til pålitelig indusere imponerende i muse hjerter. Mindre modifikasjoner er nødvendig for å bruke teknikken til rotter.

I korte trekk isolert muse hjerter Langendorff dynket i ca. 30 min med fysiologisk Krebs-Henseleit buffer (KHB), etterfulgt av kulde beskyttet hjertestans via levering av et hyperkalemic hypothermic kardioplegi løsning. Etter pågripelsen, er hjerte funksjonell bedring overvåkes under gjenoppvarming og reperfusjon av hjertet med KHB. Endringer i graden av utvinning av hjerte kontraktile funksjon kan evalueres for å vurdere kardiobeskyttende midler og forskjellige strategier for kardioproteksjon.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer ble godkjent av Livsløp Institutional Animal Care og bruk komité og alle dyr og prosedyrer i henhold til National Research Council Guide for Pleie og bruk av forsøksdyr 10. 1. Balloon Fabrication og venstre ventrikkels Pressure Monitoring Circuit Konstruer LV ballonger ifølge Miller et al. 11 I et begerglass med en rørestav, bland 9,5 ml destillert vann, 14,2 ml av lys sirup og 33,8 g sukrose, og varme på en varm plate, bl…

Representative Results

Figur 1 viser typiske resultater fra en mus eksperiment. LVP (rød linje), ble dP / dt (grønn linje) og temperatur (lilla linje) continusouly registrert over ~ 3 timer. Bokstaver angir en – utgangsmålinger, b, c, d, e – levering av kardioplegi løsning, f – starten av reperfusjon, g, h, i, j – måling av cornary strømmen under reperfusjon. Note, deprimert LVDP og dP / dt ved reperfusjon sammenlignet med utgangspunktet. Figur 1B inneholder data fra A registrert over ~ 2 sek. Legg merk…

Discussion

De foregående protokolldetaljer metoder for å evaluere hjerteinfarkt fantastisk sekundært til global iskemi forbundet med kardioplegiske arrest. I våre hender denne protokollen gir en tilnærmet ~ 40% reduksjon i hjertefunksjon (LVDP, +/- dP / dt) med minimale endringer i hjertefrekvensen på 30 min post-reperfusjon tidspunkt. Når hjertet er reperfusert og gjenoppvarmes alle parametere av hjertefunksjonen er redusert ved utgangs tidspunkter med en sterkt redusert hjertefrekvens før stabilisering mellom 20 og 30 mi…

Materials

Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters – 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures