In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
Fördjupade analyser av cancerceller proteom behövs för att klarlägga onkogena pathomechanisms, samt att identifiera potentiella läkemedelsmål och diagnostiska biomarkörer. Men metoder för kvantitativ proteomik karakterisering av patientgenererade tumörer och i synnerhet deras cellulära subpopulationer i stort sett saknas. Här beskriver vi en experimentell uppställning som möjliggör kvantitativ analys av proteom av cancercellpopulationer härledda från antingen flytande eller fasta tumörer. Detta uppnås genom att kombinera cellulära Beriknings med kvantitativ Super SILAC Baserade masspektrometri följt av bioinformatikdataanalys. Att berika specifika cellulära delmängder, är flytande tumörer först immunophenotyped med flödescytometri följt av FACS-sortering; för solida tumörer, är laser-capture microdissection används för att rena specifika cellulära subpopulationer. I ett andra steg, är proteiner som extraherats från de renade cellerna och därefter kombineras med en tumörspecifik,SILAC-märkt spik-in standard som möjliggör protein kvantifiering. Det resulterande proteinet blandningen utsattes för antingen gelelektrofores eller Filtrerings Aided Provberedning (FASP) följt av tryptisk digestion. Slutligen tryptiska peptider analyseras med en hybrid quadrupol-Orbitrap masspektrometer, och de data som erhållits behandlas med bioinformatiska programvara sviter inklusive MaxQuant. Med hjälp av arbetsflödet presenteras här, upp till 8.000 proteiner kan identifieras och kvantifieras i patientgenererade prover, och de resulterande proteinuttrycksprofiler kan jämföras bland patienter att identifiera diagnostiska proteomik signaturer eller potentiella läkemedelsmål.
Masspektrometri-baserade proteomik har vuxit och är nu en allmänt använd disciplin i cellbiologi och translationell biomedicinsk forskning. Tekniska framsteg inom området har gjort det möjligt att studera komplexa cellulära processer i cellinjer och djurmodeller, som tusentals proteiner kan identifieras i ett enda masspektrometrisk experiment 1,2. Liknande framsteg har gjorts för att analysera många posttranslationella modifieringar såsom fosforylering eller ubiquitinering, även om detta kräver oftast skräddarsydda arbetsflöden för anrikning och dataanalys för varje typ av modifiering 2,3. Dessutom medverkan av kemiska och metabola märkningsstrategier, inklusive SILAC, möjliggör noggrann relativ kvantifiering av proteiner och PTMs, vilket gör denna metod särskilt attraktiv för upptäckten av grundläggande cellulära processer, diagnostiska biomarkörer och potentiella läkemedelsmål i human cancer 4.
Emellertidflera utmaningar måste övervinnas med hänsyn till proteomik analys av primära humana cancer 5. Först av allt, humana cancerprover visar ofta en hög grad av cellulär heterogenitet som beror på närvaron av olika celltyper som hör till tumörens mikromiljö, inklusive immunceller och fibroblaster. För det andra leder klonal evolution till genetisk mångfald inom tumörerna själva, vilket resulterar i att det finns flera cellulära subpopulationer med olika funktionella egenskaper. Enligt den nuvarande konceptet några cancerstamceller vara drivkrafterna bakom cancerutveckling och progression, proteomik analys av sådana (funktionellt mycket relevanta) cellulära subpopulationer förväntas vara av stor betydelse för en bättre förståelse av onkogena mekanismer relevanta för klinisk tillämpning 6. För det tredje, är kvantitativa proteinuttrycks profiler av stora uppsättningar prover ofta krävs för att identifiera robusta kliniska BioMarskers; Detta kan inte åstadkommas genom kemisk märkning som iTRAQ 7, medan metaboliska märkningsstrategier – förlita, som de gör, på cellulär proliferation 4 – är likaså tillämpliga. För det fjärde, de flesta tillgängliga solida tumörprover är formalinfixerade, vilket komplicerar masspektrometrisk analys proteom grund av bildning av proteintvärbindningar 8. Slutligen flesta befintliga proteomik arbetsflöden kräver stora mängder provbearbetning och datainsamling, vilket gör analysen av provnummer relevanta för klinisk forskning svår, och kräver nya arbetsflödet paradigm 9,10.
För att hantera dessa hinder vi utvecklat en experimentuppställning som kombinerar antingen flödes cytometrisk cellsortering 11 eller laser-capture microdissection 12,13 för cellulär berikning med en Super-SILAC 14 strategi för att införa en global intern standard för omfattande analys masspektrometrisk. Genom att använda den här beskrivna metoden är det möjligt att kvantifiera upp till 8000 proteiner i enstaka humana tumörprover härrörande från antingen flytande eller fasta cancrar.
Det behövs Masspektrometrisk profilering av patientgenererade cancercell proteom för upptäckten av nya diagnostiska / prediktiva biomarkörer samt för att ge en bättre förståelse av cancer-cellbiologi, vilket i sin tur leder till att identifiera nya potentiella läkemedelsmål. Men sådana masspektrometriska analyser är mycket utmanande, särskilt på grund av olika pre-analytiska frågor måste lösas, om man skall få robusta och biologiskt relevanta resultat.
Den experimentella arbetsflöde beskrivs här möjliggör kvantitativ proteomik karakterisering av proteom härrör från cellulära subpopulationer av både flytande och fasta tumörer. Det behövs Den inledande anrikning av tumörceller genom att antingen FACS-baserade cell sortingor microdissection att undvika föroreningar av celler i tumören mikromiljö. Dessutom är dessa tekniker tillåter en att isolera cellulära subpopulationer av intresse. Senaste cellbiologiska studier har demonstrated att vissa cellulära delpopulationer har tumör initiera egenskaper och är därmed i högsta grad relevant för cancer patogenes 19,20. Som masspektrometri har blivit känsligare på senare år, kvantitativa proteomik analyser är möjliga för de små mängder protein som kan härledas från några tusen celler, vilket gör det möjligt att fokusera på funktionellt relevanta cellpopulationer.
Upplägget presenteras här kan användas för att identifiera och validera nya diagnostiska biomarkörer i FFPE prover. Därför lovar att bea användbart verktyg för att förbättra klinisk diagnostik, som hittills finns det fortfarande en brist på molekylära biomarkörer i tillräckligt antal och kvalitet för många cancertyper. Viktiga exempel på svåra differentialdiagnoser, för vilka biomarkörer saknas, är det diskriminering mellan primär lungcancer från metastaser i lungan, intrapancreatic cholangiocellulära cancer och bukspottskörteln adenokarcinom, samt skiljerentiation av godartad neurofibrom från mycket maligna perifera nerv slida tumörer. Dessutom har vi och andra visat att kvantitativ belysning av proteomik signaturer kan vara användbart för att studera cancer cellbiologi i allmänhet och för att avslöja prediktiva biomarkörer för terapeutiskt svar hos cancerpatienter 21.
Två nuvarande nackdelar med den metod som presenteras här är kravet på omfattande manuell provbearbetning och efterfrågan på nanoLC-MS / MS-förvärvstiden. Medan den förstnämnda kan åtgärdas genom att flytta provberedning till t.ex. 96-format och med hjälp av robotbearbetning, kommer det senare att kräva en förändring av mass strategi spektrometrisk förvärvet. När delmängder av målproteiner har identifierats som kan vara förknippade med t.ex. tumörklassificering, tänka vi utformningen av riktade masspektrometri metoder som ger kvantitativa avläsning för dessa undergrupper med en kraftigt reducerad separation ansträngning, ochdärför med en motsvarande minskad förvärvstiden. Om önskad förvärvs tid som krävs kan minskas 24-36 tim (flytande tumörer) eller 3 tim (solida tumörer) till t.ex., 1 timme med hjälp riktade masspektrometri och en enkel endimensionell separation av peptider, då vinst i genomströmning skulle kunna användas för att avsevärt öka antalet biologiska och tekniska replikat undersökta, med motsvarande förbättringar i betydelsen av kvantifiering resultat. Riktade masspektrometriska metoder har redan visat sig vara ett lämpligt verktyg för kontroll av cancerassocierade protein biomarkörer-kandidater 22, och har utvecklats till en punkt där de visar lovande för validering eller ens som ett potentiellt verktyg för rutinmässig klinisk användning 23 , 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |