Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)

Resumo

Os exossomos são estruturas microvesiculares encontradas em biofluidos que potencialmente carregam importantes biomarcadores discriminatórios de doenças. Aqui, um novo método é usado para extrair especificamente exossomos e testar rapidamente a carga exossômica para ambos os alvos de RNA / proteína após a interrupção de exossomos usando ondas quadradas cíclicas elétricas não uniformes.

Resumo

Exossomos são estruturas microvesicular que desempenham um papel de mediação na comunicação intercelular. É de interesse para o estudo da carga interna de exossomos para determinar se eles são portadores da doença biomarcadores discriminatórias. Para a realização de análise exosomal, é necessário desenvolver um método para a extracção e análise de exossomas a partir de fluidos biológicos alvo sem danificar o conteúdo interno.

Libertação eléctrica induzida por campo e medição (Efirm) é um método para a extracção especificamente exossomas a partir de fluidos biológicos, descarregar as suas cargas, e testando o seu conteúdo de ARN / proteína interna. O uso de um anticorpo CD63 específico de micropartículas magnética anti-humana, exossomos são primeiro precipitado a partir de fluidos biológicos. Após a extracção, de baixa tensão ondas quadradas eléctricas cíclicos (CSW) são aplicados para romper a membrana vesicular e causar o descarregamento da carga. O conteúdo do exossoma é hibridado com iniciadores de ADN ou de anticorpos imobilizados numa superfície de eléctrodo para quantification de teor molecular.

O método Efirm é vantajoso para a extracção de exossomas carga e descarga para análise sem tampão de lise. Este método é capaz de efectuar a detecção específica de ambos os alvos de ARN e proteína de biomarcadores na exossoma. Efirm extrai exossomas especificamente com base nos seus marcadores de superfície, em oposição a técnicas baseadas em tamanho.

A microscopia electrónica de transmissão (TEM) e ensaio de demonstrar a funcionalidade do método de captura e análise de exossoma. O método foi aplicado para Efirm exosomal análise de 9 ratinhos injectados com células de pulmão humano H640 do cancro (uma linha de células transfectadas para expressar o marcador CD63 humano exossoma-GFP), a fim de testar o seu perfil contra exossoma 11 ratinhos que receberam controlos de solução salina. Níveis elevados de biomarcadores exosomal (GAPDH gene de referência e proteína de superfície do marcador CD63 humano-GFP) foi encontrado com o H640 injetaram em ratos em ambas as amostras de soro e saliva. Além disso, saliva e amostras de soro foram demonstradas ter linearidade (R = 0,79). Estes resultados são sugestivos para a viabilidade de biomarcadores de exossoma salivares para a detecção de doenças distais.

Introdução

Pesquisa exosome é um campo emergente de investigação que examina microvesículas lipídicas que carregam ^um RNA, DNA ^{2, 3} e proteína de carga. Inquéritos anteriores da biologia exosome levaram a identificação de exossomos em fluidos biológicos como sangue ^{4, 5} urina, leite materno ^{6, 7} e saliva. Estudos têm demonstrado que os exossomas desempenhar um papel em diferentes vias celulares, meditar remotamente a comunicação entre diferentes sistemas do corpo ^8. Devido ao papel exossomas desempenhar na comunicação intercelular, é a hipótese de que eles podem empacotar alvos biomoleculares (proteína, RNA e DNA) correlaci....

Protocolo

1. magnética baseado no grânulo exossomo Extracção

1. Pipetar uma solução bem agitada de 5 mL de micropartículas magnéticas revestidas de estreptavidina em 495 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), tampão num tubo de microcentrífuga para ressuspender as esferas. Lavar e ressuspender as esferas com 500 ul de PBS três vezes usando uma cremalheira magnética. A cremalheira é uma matriz de magnetos na parte lateral de uma unidade de alojamento, que pode prender os tubos de amostra de microcentrífuga.
   1. Para cada lavagem, primeiro deixe-os tubos de sentar-se no rack para 1 min, e em seguida, usar uma ponteira para remover cuidadosamente o buffer ....

Resultados

Validação de exossomo Captação de contas usando TEM

Isolamento de exossomos de saliva usando CD63 esferas magnéticas anti-humanos foi validado seguindo o protocolo de extração, utilizando imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET). TEM mostra esferas magnéticas com grânulos 70-100 nm imediatamente adjacentes (ver Figura 3A, 3B e), de acordo com o perfil conhecido de exossomos. Não foram observados grânulos de 70-100 nm para as esferas magnéticas .......

Discussão

Como os resultados indicam, CD63 anti-humano revestido nanopartículas magnéticas são capazes de capturar especificamente pequenas partículas que têm um tamanho que varia 70-100 nm. Esta partícula capturado é consistente com o perfil observado anteriormente de exossomas. Além disso, o uso da CSW baixa voltagem após a captura das partículas é mostrado para removê-los da superfície do grânulo e provocar perfis de degradação de ADN semelhante ao de um método tradicional de tampão de lise com base para a libertação da carga........

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de Leitor de 16 Canais Helios com Interface de Chip	Genefluidics, EUA&	nbsp; RS-1000-16
16x Chip Sensor, Bare Gold, pacote de 5 chips	Genefluidics, EUA	SC1000-16X-B
Biotinilado anticorpo CD63 humano	Ancell, EUA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, EUA	65601
Neodímio Magnetics (1/10" de diâmetro x 1/32" de espessura)	K& J Magnetics, EUA	DH101
Água Destilada Ultrapura	Life Technologies, EUA	10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl Solution	Fisher Scientific, EUA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, EUA	W338605-100g
Anti-Fluoresceína-POD, Fragmentos de Fab	Roche, Alemanha	11426346910
substrato de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB/H2O2, baixa atividade)	Neogen, EUA	330175
Solução salina tamponada com fosfato	Life Technologies, EUA	10010023
Caseína/PBS	Fisher Scientific, EUA	37532