Indoxyl glycosides zijn goed gevestigde en veelgebruikte hulpmiddelen voor enzymscreening en het bewaken van enzymactiviteit. Vooral voor glucose-type structuren bleken eerdere syntheses uitdagend en met een lage opbrengst. Onze nieuwe aanpak gebruikt indoxylzuur esters als waardevolle tussenproducten om een aanzienlijk aantal indoxyl glycosides met een goede opbrengst te verkrijgen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Synthese van Indoxyl-glycosiden voor detectie van Glycosidase Activiteiten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Indoxyl glycosiden bleken waardevolle en veelzijdige hulpmiddelen te zijn voor het monitoren van glycosidase-activiteiten. Indoxylen worden vrijgegeven door enzymatische hydrolyse en worden snel geoxideerd, bijvoorbeeld door atmosferische zuurstof, tot indigo-kleurstoffen. Deze reactie maakt snelle en eenvoudige screening in vivo mogelijk zonder isolatie of zuivering van enzymen, evenals snelle tests op agarplaten of in oplossing (bijv. blue-white screening, micro-wells) en wordt gebruikt in biochemie, histochemie, bacteriologie en moleculaire biologie. Helaas bleek de synthese van dergelijke substraten moeilijk, vanwege verschillende nevenreacties en de lage reactiviteit van de indoxyl hydroxyl functie. Vooral voor glucose type structuren werden lage opbrengsten waargenomen. Onze nieuwe aanpak gebruikt indoxylzuur ester als sleutel tussenproducten. Indoxylzuur esters met gevarieerde substitutiepatronen werden bereid op schaalbare paden. Faseoverdracht glycosyleringen met die acceptoren en peracetyleerde glycosyl halogeniden kunnen onder gewone omstandigheden in hoge opbrengsten worden uitgevoerd. Ester splitsing en daaropvolgende milde zilver gemedieerde glycosylering levert de peracetyleerde indoxyl glycosiden in hoge opbrengsten op. Ten slotte wordt de deprotectie uitgevoerd volgens Zemplén.
Inleiding
Gedurende een lange periode was de productie van indigo een economisch zeer belangrijk proces. Voordat grootschalige chemische syntheses een goedkope toegang tot indigo boden, werden precursoren sinds voorchristelijke tijden uit natuurlijke bronnen verkregen. De teelt van indigo-producerende planten (natuurlijk indigo) in Europa werd in de 17e eeuw onrendabel, aangezien de hoeveelheid indigo-precursoren van de Indiase indigoplant (0,2-0,8 %) ongeveer 30 keer hoger is. Aan het einde van de 19e eeuw verving de chemische synthese van indigo de conventionele teelt1,2.
Indigo-precursoren die van nature in planten voorkomen,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Algemene opmerkingen:
Alle reacties werden uitgevoerd in een afzuigingskast en met geschikte beschermende kleding. Alle reagentia en oplosmiddelen (p.a.; watergehalte voor droge oplosmiddelen: MeCN <50 ppm; Et2O <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) werden aangeschaft bij commerciële leveranciers en werden gebruikt zoals ontvangen. TLC werd uitgevoerd op Merck silica gel 60 F254 platen. Verbindingen werden gedetecteerd door UV en/of door behandeling met EtOH/H2SO4 (9:1) en vervolgens verwarmen. Kolomchromatografie werd uitgevoerd met Merck/Fluka silica gel 60 (230-400 mesh). Filt....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De allereerste syntheses van indicane en 5-broom-indicane werden al in 1927 en 1929 gepubliceerd door Robertson15,16. Door gebruik te maken van indoxylozuurmethylester als acceptor werd de reactieve 2-positie geblokkeerd, waardoor nevenreacties gedeeltelijk werden onderdrukt. Glycosylering in aceton/natriumhydroxide, gevolgd door beschermgroepverwijdering en decarboxylering (160 °C, azijnzuuranhydride, 1 uur) en tot slot deacetylering, leverde indicane en 5-broom-indicane op. Op basis van dit concept hebben we.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vanwege lage opbrengsten en beperkingen, vooral voor glucosetype structuren en complexere suikers, werd een nieuwe synthetische benadering voor indoxyl glycosiden ontwikkeld. Indoxylzuur esters bleken waardevolle tussenproducten te zijn en werden verkregen in een modulair, schaalbaar proces. Alle stappen leveren hoge opbrengsten op en vanwege goedkope uitgangsmaterialen en eenvoudige nabehandeling zijn syntheses in grammen mogelijk. Het voordeel van de allyl-ester benadering is het blokkeren van de reactieve 2-positie. H.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De steun van dit werk door Glycom A/S, Kopenhagen, Denemarken, wordt met dank erkend.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azijnzuuranhydride | Grüssing | 10298 | Corrosie, ontvlambaar |
| Acetonitril | Sigma-Aldrich | 608-001-00-3 | Schadelijk, ontvlambaar |
| Allylalcohol | Aldrich | 453021 | Schadelijk, gevaarlijk voor het milieu |
| Amberlite IR-120 H+ | Fluka | 06428 | Irritativum |
| Broomazijnzuur | Merck | 802260 | Corrosie, giftig, gevaarlijk voor het milieu |
| 4-Broom-3-chloor-2-methylaniline | ABCR | AB 171687 | Irritativum |
| Dichloormethaan | ACROS | 326850010 | Schadelijk |
| Di-ethylether | Grüssing | 10274 | Schadelijk, zeer ontvlambaar |
| Dimethylformamide | ACROS | 348430010 | Schadelijk, ontvlambaar |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | 41648 | |
| Ethylacetaat | Sigma-Aldrich | 607-022-00-5 | Irritativum, ontvlambaar |
| Etheen-diamine-tetra-azijnzuur | AppliChem | A1103.0500 | Irritativum |
| β1,3-Galactosidase, recombinant, E. coli | Calbiochem | 345795 | |
| Zoutzuur | VWR | 20252.290 | Corrosie |
| Magnesiumsulfaathydraat | Merck | 105885 | |
| Methanol | ACROS | 326950010 | Giftig, ontvlambaar |
| Morpholine | Janssen Chimica | 15.868.57 | Corrosie, ontvlambaar |
| Petroleumether | Azelis | 111053 | Ontvlambaar, irriterend, gevaarlijk voor het milieu |
| Kaliumcarbonaat | Grüssing | 12005 | Corrosie |
| Kaliumpermanganaat | Grüssing | 12056 | Schadelijk, oxiderend |
| Kalium-tert-butoxide | Merck | 804918 | Corrosie, ontvlambaar |
| Pyridien | Sigma-Aldrich | 613-002-00-7 | Schadelijk, ontvlambaar |
| Zilveracetaat | Fluka | 85140 | Irritativum, gevaarlijk voor het milieu |
| Natriumbicarbonaat | Grüssing | 12144 | Corrosie |
| Natriumhydride | Merck | 814552 | Corrosie, ontvlambaar |
| Natriumhydroxide | Riedel-de Häen | S181200 | Corrosie |
| Natriummethoxide | Merck | 806538 | Corrosie, ontvlambaar |
| Natriumsulfaat | Grüssing | 12175 | |
| Tetrabutylammonium-waterstofsulfaat | Lancaster | 5438 | Schadelijk |
| Tetrahydrofuraan | Sigma-Aldrich | 87371 | Schadelijk, ontvlambaar |
| Tetrakis (trifenylfosfine)palladium(0) | Sigma-Aldrich | 216666 | |
| Trifosgeen | Fluka | 15217 | Giftig |
| Tris (hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride | Sigma | T-3253 | Irritativum |
Referenties
- Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present. Endeavour. 17, 191-199 (1993).
- Hunger, K. Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
