En Piglet Modell av neonatal hypoxisk-ischemisk encefalopati

Summary

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Abstract

Förlossningsasfyxi, som orsakar hypoxisk-ischemisk encefalopati (HIE), står för 0.660.000 dödsfall i världen varje år, ungefär en fjärdedel av världens 2,9 miljoner neonatala dödsfall. Djurmodeller av HIE har bidragit till förståelsen av patofysiologin i HIE, och har visat att dynamisk process som förekommer i hjärnskada på grund av perinatal asfyxi. Sålunda har djurstudier föreslog en tidsfönster för post-insult behandlingsstrategier. Hypotermi har testats som en behandling för HIE i pdiglet modeller och därefter visat sig effektiv i kliniska prövningar. Variationer av modellen har tillämpats i studiet av adjunktiva neuroprotektiva metoder och Nasse studier av xenon och melatonin har lett till klinisk fas I och II studier ^1,2. Den smågris HIE modellen används vidare för nyfödda resuscitation- och hemodynamiska studier samt i undersökningar av cerebral hypoxi på cellnivå. Emellertid är det en tekniskt utmanandemodell och variationer i protokollet kan leda till antingen för lätt eller för svår hjärnskada. I den här artikeln visar vi de tekniska förfaranden som är nödvändiga för att etablera en stabil smågris modell av neonatal HIE. Först nyfödda smågris (<24 timmar gammal, median vikt 1500 g) sövdes, intuberades, och övervakas i en uppställning som är jämförbar med den som finns i en neonatal intensivvårdsavdelning. Global hypoxi-ischemi induceras genom att sänka inandningssyrefraktionen att uppnå global hypoxi, ischemi genom hypotension och en platt spår amplitud integrerad EEG (AEEG) indikerar cerebral hypoxi. Överlevnad främjas genom att justera syresättning enligt AEEG respons och blodtryck. Hjärnskada kvantifieras genom histopatologi och magnetisk resonanstomografi efter 72 timmar.

Introduction

Perinatal asfyxi är en akut och ofta oförutsett tillstånd associerade med hypoxisk-ischemisk encefalopati (HIE). Det övergripande målet med detta protokoll är att visa en smågrisarnas överlevnad modell för perinatal hypoxisk-ischemisk encefalopati. Denna modell kan användas för att undersöka effekten av olika grader av hypoxi-ischemi på neonatal hjärnan och experimentella behandlingar på neuropatologi, magnetisk resonanstomografi och spektroskopi (MRI och MRS) och biomarkörer i kroppsvätskor, såsom blod, cerebrospinalvätska och urin . Modellen har också visat sig vara användbara för att undersöka det kardiovaskulära systemet, andningssystemet, njure och lever, vilka alla påverkas på globala hypoxi-ischemi.

Perinatal asfyxi är ett resultat av nedsatt syretillförsel intrapartal eller i dess omedelbara post-partum period. Intrapartal hypoxiska händelser står för 0.660.000 dödsfall i världen varje år, ungefär en fjärdedel av världens 2,9 million neonatala dödsfall under 2012 ^3. År 2010 1,15 miljoner barn uppskattades ha utvecklat neonatal encefalopati efter förlossningsasfyxi ^4. HIE definieras som encefalopati hos spädbarn födda efter 34 graviditetsveckor sker i 1-3 / 1000 levande födda ⁵ i den industrialiserade världen och upp till 8,5 / 1000 levande födda i utvecklingsländer ^4. Risken för död är 10-60%, och risken för neurologiska handikapp i överlevande 30-100% ^6,7. 50.200.000 funktionshinder justerade levnadsår (DALY) tillskrivs intrapartal hypoxiska händelser ^4. För närvarande är den enda behandling än stödjande för HIE är efter hypoxisk hypotermi. Således framsteg inom diagnostik och behandlingsstrategier är avgörande för att förbättra förvaltningen av HIE ^8.

Förbättringar i prognosen efter perinatal asfyxi och förvaltning av neonatal hjärnskada bygger på att öka kunskapen om mekanismerna bakom sjukdoms end möjliga behandlingar. Djurmodeller av HIE är särskilt användbara som olika kliniska händelser kan leda till HIE och förekomsten i en enskild födelse centrum är låg ^5. En experimentuppställning där påverkan av biologisk variation kan minimeras, är viktigt när man testar nya prognostiska och diagnostiska verktyg och behandlingsstrategier. En djurmodell bör närma den kliniska situationen så nära som möjligt och därmed bidra till förståelsen av de patologiska mekanismerna bakom den inducerade skadan och den dynamiska process som krävs i sjukdomen och det är resultatet ^9. Djurmodeller av neonatal HIE har inkluderat ett antal arter, inklusive gnagare, lamm och svin. I jämförelse har det nyfödda spädgris högre likhet med en human nyfödda med avseende på storlek, hjärt-kärlsystemet ¹⁰ och hjärna mognad vid tidpunkten för leverans ^11,12. Övervakning, instrumentering och utvärdering av resultatet i smågris modellen liknar that används i klinisk vård av barn med HIE. Följaktligen finns det en hög grad av översättning till vård av nyfödda från denna modell.

Smågrisar modeller av perinatal hypoxi och HIE används av många grupper och varierar i ett antal områden ^13. Enligt syftet med försöket, måste uppmärksamhet ägnas åt valet av läkemedel, metod för att inducera hypoxi-ischemi, metod för att styra förolämpning varaktighet och svårighetsgrad, efter förolämpning återupplivning och omsorg, och resultatet utvärdering. För att undvika en snedvridning en randomiserad studie design bör alltid användas i interventionsstudier.

Den metod som används vid induktion av hypoxisk-ischemisk skada är viktigt. Globalt hypoxi som leder till HIE resulterar ofta i ett misslyckande i flera organ inbegriper hjärnan, hjärtat, lungorna, njurarna och levern. Beroende på resultaten utvärderas, bör modeller från HIE baseras på globala hypoxi och ischemi i stället förlita sig på fokal ischemi, t ex., Genom ligering av bilotid artärer ^14. En nyligen papper appliceras en kombination av hypoxi (FiO ₂ 12%) och halspulsådern kompression medan det genomsnittliga arteriella blodtrycket> 40 mm Hg ² bibehållande. En annan grupp inducerad global hypoxi med 8% _O2 tills negativt basöverskott> 20 mmol / l eller genomsnittligt arteriellt blodtryck (MABP) <15 mm Hg, och avlivades djuren vid 4 h ^15. Hypoxi har också titreras genom hjärtminutvolym (till 30-40% av baslinjen), MABP (till 30-35 mm Hg) och arteriell pH (6,95-7,05) ^16.

Modeller av global hypoxi-ischemi titreras genom AEEG undertryckande liknande den som presenteras i denna rapport har visat encefalopati som är kliniskt, elektrofysiologiskt och neuropatologiskt jämförbar med tillstånd finns i asphyxiated sikt spädbarn ^17,18.

Graden av HIE inducerad är viktigt. En användbar djurmodell för HIE måste också göra det möjligt att testa nya diagnostiska procedurer och behandlingsalternativ. För att möjliggöra detta bör modellerna inducerar måttlig HIE där det finns en behandling potential som svår hjärnskada med liten eller ingen behandling potential skulle vara mindre relevanta när man utvärderar nya behandlingar. Tolerans till hypoxi varierar kraftigt mellan försöksdjuren. Tidigare studier har visat att man kan uppnå en jämnare hjärnskada och att fler djur överlever ^17,19 genom individualisering av hypoxi enligt varje Nasses cerebral svar utvärderas av amplitud integrerad elektroencefalografi (AEEG) snarare än att använda ett värde set FiO ₂ hela hypoxisk händelse. Varaktigheten av AEEG undertryckande korrelerar till graden av hjärnskada, med några histopatologiska förändringar på <20 min AEEG undertryckande och allvarliga kramper ökar i> 45 min AEEG undertryckande. En nyligen genomförd granskning av neuroprotektiva behandlingar för HIE identifierat behovet av överlevnad modeller möjliggör beteendeutfallsmåttderna i djurmodeller ^20.

Det finns många fördelar med det presenterade HIE Nasse modell. Den är baserad på en art där resultaten är i hög grad sannolikt att översätta till den mänskliga fysiologin. Globala hypoxi-ischemi modeller multiorgansvikt och titrering av hypoxi-ischemi genom AEEG framkallar en konsekvent grad av hjärnskada med överlevnads kliniskt relevanta resultat så att biomarkörer, MRI och beteende kan utvärderas på relevanta tidpunkter.

Nasse modeller av perinatal asfyxi och HIE har inte bara bidragit avsevärt till aktuell inblick i HIE patofysiologi, men har också framgångsrikt föregås kliniska prövningar, i slutändan resulterar i nya behandlingar hos människor. Nasse modellstudier har spelat en nyckelroll i upprättandet hypotermi som behandling för HIE ^21, och används i neonatal återupplivning forskning ^22. Olika grupper har använt smågris modeller när de utför forskning inom asfyxi och HIE, end studier omfattar hypotermi ^23, alfa-melanocytstimulerande hormon ^24, hjärtstillestånd ^25, tyrosinhydroxylasaktivitet ^26, upprepad hypoxisk exponering ^27, NMDA-receptoraktivitet ¹⁴ och nära-infrarödspektroskopi ^28.

Den smågris modell HIE presenteras i denna rapport är tekniskt utmanande att arbeta med, som mindre justeringar under loppet av förfarandet kan leda till antingen för lätt eller för svår hjärnskada ^29,2. Vi fann att den befintliga litteraturen saknade tillräcklig detalj för att reproducera tidigare publicerade modeller. Således, här visar vi varje steg av de tekniska förfaranden som är nödvändiga för att upprätta en griskulting 72 timmar överlevnad modell i denna rapport, gör det möjligt för forskare att etablera denna avancerade modell för studier av HIE.

Protocol

Det nuvarande protokollet godkändes av det danska djurförsöksInspektionen. Alla försöksdjur sövdes hela förfarandena. Reproduktion av detta protokoll skall utföras i enlighet med nationella etik och riktlinjer för djurskydd och godkännas av lokala etiska kommittéer. 1. Djur Danska lantras smågrisar <24 timmar gammal väger ca 1.500 – 2.000 g. 2. Anestesi och underhåll vätskor Förbered den utrustning som behövs för a…

Representative Results

Effekterna av hypoxi-ischemi på hjärnan som inträffar under den inducerade insult dokumenteras genom registrering AEEG spår. En representativ AEEG kontur visas i fig 6. Figur 6. Representativa AEEG spår. Låg amplitud på grund av hypoxi-ischemi. Klicka här …

Discussion

På grund av dess komplexitet, kan den beskrivna modellen endast genomföras i anläggningar som är ackrediterade och erfarna i djurförsök. Godkännande av lokala etikkommittéer måste erhållas före initiering av experimenten, och optimal djurskydd måste garanteras vid alla tidpunkter. Eftersom modellen är baserad på överlevnaden av testdjuren, är det viktigt att en steril miljö upprätthålls under invasiva förfaranden för att förhindra infektioner.

Valet av anestesi är vikt…

Materials

Warm-touch-pediatric blanket	Covidien	5030840
Adhesive Apertrue Drape	Barrier	915447
Utility Drape (sterile) 75×80 cm	Barrier	800530
Neoflon	BD – Luer	391350
Laryngoscope	Miller	85-0045
Endotracheal tube 2.5 mm	Covidien	111-25
Endotracheal tube 3.0 mm with cuff	Unomedical	MM61110030
Endotracheal tube 3.5 mm with cuff	Unomedical	MM61110035
Anesthesia machine	GE Healthcare	1009-9002-000
EEG – electrodes/disposable subdermal needle electrode	Cephalon	ACCE120550
ECG – electrodes	medtronic	3010107-003
ECG-electrodes for MR	philips	ACCE120550
Arterial blood sampler – aspirator	Radiometer medical ApS	956552
Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch)	Covidien	8888160341
Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch)	Covidien	8888160333
Suture set (size 3-0)	Covidien	8886 623341
BD Spinal needle 0.7x38mm	BD needles	405254
Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen	Air Liquide	made on order
NeuroMonitor (CFM) system	Natus Medical Incorporated	OBM70002