This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.
本報告では、ex vivoで解剖異種移植腫瘍のフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡使用して、インビボで異種移植イメージング実験の検証のための近赤外フルオロフォア標識プローブの実装について述べる。我々は、単一ドメインのナノボディ(単数+ 16aは、17 kDa)の1およびインビボで特定の同じ標的抗原に対するモノクローナル抗体(Nika102、150 kDa)の2,3を比較する近赤外線リンパ腫異種移植片モデルにおける蛍光イメージング。標的抗原のADPリボシルトランスフェラーゼARTC2.2はリンパ腫細胞4-9によるGPIアンカー型細胞表面エクト酵素として発現される。
ラクダ科動物重鎖のみ抗体に由来するナノボディは、最小の利用可能な抗原結合断片10,11です。唯一の〜15kDaのによると、これらの小さな抗体フラグメントは、可溶性の非常に安定しており、腎循環8,10から消去されます。 THESEプロパティは、生体 12-20 における腫瘍抗原の特異的かつ効率的な標的化のために特に適したものにする。利用可能なナノボディの共通の抗原標的は、上皮成長因子受容体(EGFR1またはHER-1)、ヒト上皮成長因子2型(HER-2またはCD340)、癌胎児性抗原(CEA)および血管細胞接着分子-1(VCAM-1である)21。ナノボディの結合体は、炎症性疾患22の癌免疫療法と治療のための有望なツールです。
最近の研究では、高い腫瘍対バックグラウンド(T / B)は、 インビボでの分子イメージングアプリケーション8,17,19、従来の抗体より-ratiosナノボディが許可されていることを示している。これは、非標的組織23に、従来の抗体、循環からの遅いクリアランス、および長い保持の比較的乏しいと遅い組織浸透によって主に説明されている。さらに、従来の抗体の過剰非特異的蓄積をiに導く強化された透過性および保持(EPR)によって引き起こされるn個の標的抗原陰性腫瘍は24,25をもたらす。これは、従来の抗体の高い用量は、このように最大の達成可能な腫瘍対バックグラウンド比を減少させる、特定の信号だけでなく、非特異的なシグナルだけでなく、増加させることができることを意味する。対照的に、ナノボディの用量を増加させることなく、正常組織または抗原陰性腫瘍(未発表データ)の抗原陽性腫瘍のシグナルを増加させる。
ナノボディと、従来の抗体の比較を超えて、我々が原因EPR効果に特定し、非特異的なシグナルの直接比較のために同じマウスにおける抗原陽性と陰性異種移植片の個人内評価の概要を説明します。近赤外蛍光団結合プローブは、私たちは、近赤外蛍光イメージングを用いたin vivoおよびex vivoで単一のプローブを利用するフローサイトメトリー、および蛍光顕微鏡することができました。我々のプロトコルを適用することを可能にする非そのような特定の腫瘍が標的とするための新たな抗体構築物の評価などの生体内分子イメージング実験の、放射性、高感度、かつ安価な最適化。
このチュートリアル研究の目的は、前臨床分子イメージングの新抗体構築物の評価のためのNIRFイメージングの使用を強調することです。
このプロトコルでは、すべての実験小動物NIRF·イメージングシステムを用いて実施した、蛍光活性化セルソーター(FACS)は、フローサイトメーターおよび共焦点顕微鏡。
我々 は、in vivo及びex vivoでの分析のマルチモーダル比較のために、リンパ腫細胞上で同じターゲットに対して向けられた近赤外蛍光団ラベルナノボディ、従来のモノクローナル抗体を使用していました。我々は、ナノボディはよくリンパ腫の迅速かつ特異的インビボ検出のための診断ツールとして適していることを示した。
生体内では 、+ 16(a)680は ARTC2陽性異種移植片の迅速かつより具体的な検出を可能にしたのです。別に、in vivoでの最高の腫瘍の可視化のための異なる反応速度論から、Nika102 680の主な欠点は、ARTC2陰性腫瘍と、非特異的バックグラウンドシグナルより高い非特異的なシグナルであった。
解剖腫瘍が注入されたAF680-結合体のARTC2陰性リンパ腫細胞への非特異的な結合を示さなかったからex vivoでのフローサイトメトリーは、分散した細胞の解析。 エクスビボ蛍光はほとんどhomogen強く明らかにし、ナノボディーS + 16aの場合のART2C陽性腫瘍切片内の細胞のOUの染色、ナノボディーは6時間後に腫瘍内のさえ遠隔地に到達することができたことが確認された。対照的に、モノクローナル抗体は、6時間後ARTC2陽性腫瘍における細胞の弱く不均一な染色を示した。従来の抗体との良好な撮像結果は、24時間または48時間後に達成することができる(データは示さず)。異なる2つのサイズの構築物の完全な比較を行うために、異なる時点(シリアルイメージング)での撮像は、各構築物のための最適な撮像時点を特定するために実行されなければならない。
他の先行研究と同様に、ここに報告された結果は、in vivoでラベルナノボディーとの分子イメージングは高い腫瘍対バックグラウンド比12-15,17-19と迅速かつ特異的に同じ日の腫瘍イメージングを可能にすることを強調。逆に、従来の抗体は、低腫瘍対バックグラウンド比と抗からの非特異的なシグナルになる初期の身体からの遅いクリアランスのために注射後GEN陰性腫瘍。従来の抗体との最適な撮像結果を得るためには、撮像時間が24時間を指し、または注射後にも48時間は、一般的に必要とされる。これらの知見は、実績のある治療上の有益性と、従来の抗体は、分子イメージング17,19,26において有用性が限られていることが示唆されている以前の研究と一致している。ナノボディは、循環からの彼らの急速なクリアランスのために画像化目的のためにむしろ適していながら、そのため、従来の抗体は、その長い血漿半減期に治療目的ではなく、適しているかもしれません。これらの差は大きく、従来の抗体(150 kDa)の過剰の循環に保持されている間に小さいナノボディ(15-17 kDa)のいずれかの過剰が急速に腎排泄を介してクリアされるという事実に起因する。そのように、分子イメージングのためのナノボディの主な利点は、初期の撮像時点での低いバックグラウンドシグナルであるregardl注射量のESS。これは、同じ日のイメージングを可能にし、臨床の設定に変換可能である可能性があります。これに反して、従来の抗体は、標的組織(未発表データ)から十分な特定の信号を維持しながら、正確に、非特異的なバックグラウンド信号を最小化するために滴定する必要があります。
インビボでの NIRFイメージング技術の限界の一つは、一般的ではなく同所腫瘍モデルの皮下のみの画像化を可能にする低浸透深さである。しかし、この制限は、マウス27を生きた全身イメージングを可能最近開発された断層光音響技術により実験的設定で克服されることがあります。 NIRFイメージング技術の他の制限は、放射性核種媒介イメージングと比較して組織量の評価である。しかし、ナノボディは、異種移植モデルとの正確な定量的評価の陽電子放出断層撮影(PET)イメージングのために放射性標識することができるトレーサー生体内分布。確かに、私たちのNIRFイメージングの結果は、PETイメージングのためのナノボディと、従来の抗体を比較した最近の研究に基づいている。著者はまた、ナノボディーが高い腫瘍対バックグラウンド比15と同じ日のイメージングを可能という結論に達しました。
しかしながら、近赤外蛍光色素AF680との抗体構築物の唯一の標識化は、 インビボで 、私たちのin vitroでの総合的な許可及びex vivo近赤外蛍光イメージング比較フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、およびNIRFイメージング使用。このため、それは、非放射性高感度、安価で、比較的簡単に製造するターゲットプローブを使用しているため、我々は、前臨床分子イメージングの新しい抗体構築物の評価のためのNIRFイメージング技術の使用を提唱する。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ドイツ学術振興(フリードリヒコッホ-·ノルティ)の共同研究センター877によって、ドイツ学術振興(アレクサンダーレンツ、バレンティンKunick、ウィリアムFumey)の共同研究センター841の大学院「炎症と再生」によってサポートされていました、ヴェルナー·オットー財団(ピーターBannas)によって、ヴィルヘルムサンダー財団(ピーターBannas、フリードリッヒコッホ-·ノルティ)によると、ドイツ学術振興(マーティン·トレペル、フリードリヒハーグとフリードリッヒコッホ·ノルティ)による。私たちは、 インビボ光学イメージングコア施設とスタッフUKEで相談し、その高品質のサービスでは大学がんセンターハンブルク(UCCHを)感謝。コア施設はドイツKrebshilfe(ドイツ癌エイド)からの助成金によって部分的にサポートされていました。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | n/a | Other cells with different surface targets can be used |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |