Vurdering av bakterieinvasjon av hjerteceller i kultur og hjertekolonisering hos infiserte mus ved hjelp av Listeria monocytogenes

Summary

Listeria monocytogenes forårsaker fosterinfeksjoner hos gravide kvinner og meningitt i utsatte populasjoner. Subpopulasjoner av bakterier kan kolonisere hjertevev, forårsaker myokarditt hos pasienter og laboratoriedyr. Her presenterer vi en protokoll som beskriver hvordan man vurderer L. monocytogenes hjertecelleinvasjon in vitro og hjertekolonisering hos smittede dyr.

Abstract

Listeria monocytogenes er et Gram-positivt fakultets intracellulært patogen som er i stand til å forårsake alvorlige invasive infeksjoner hos immunkompromitterte pasienter, eldre og gravide kvinner. De vanligste manifestasjonene av listeriose hos mennesker inkluderer meningitt, encefalitt og fosterabort. En betydelig, men mye mindre dokumentert oppfølger av invasiv L. monocytogenes infeksjon involverer hjertet. Dødsraten fra hjertesykdom kan være opptil 35% til tross for behandling, men svært lite er kjent angående L. monocytogenes kolonisering av hjertevev og dets resulterende patologier. I tillegg har det nylig blitt tydelig at subpopulations av L. monocytogenes har en forbedret kapasitet til å invadere og vokse innen hjertevev. Denne protokollen beskriver i detalj in vitro- og in vivo-metoder som kan brukes til å vurdere kardiotropisme av L. monocytogenes isolerer. Metoder presenteres for infeksjon av H9c2 rotte hjerte myoblaster i vevskultur samt for bestemmelse av bakteriell kolonisering av hjertene til infiserte mus. Disse metodene er nyttige ikke bare for å identifisere stammer med potensial til å kolonisere hjertevev hos infiserte dyr, men kan også lette identifisering av bakterielle genprodukter som tjener til å forbedre hjertecelleinvasjon og / eller drive endringer i hjertepatologi. Disse metodene sørger også for direkte sammenligning av kardiotropisme mellom flere L. monocytogenes stammer.

Introduction

Listeria monocytogenes er et Gram-positivt intracellulært patogen som er i stand til å forårsake alvorlig sykdom i utsatte populasjoner, inkludert eldre, gravide kvinner, personer med HIV / AIDS og personer som mottar kjemoterapi¹. Infeksjon i disse populasjonene er ofte et resultat av inntak av forurensede matvarer, og de fleste infeksjoner er forbundet med store matbårne utbrudd^2,3. Hos mennesker og andre pattedyr er L. monocytogenes i stand til å translokalisere over tynntarmens epitelgrense, og deretter transporteres til leveren^4,5. Dyremodeller antyder at inntatte bakterier replikerer i tarm villi og transitt til leveren gjennom portalvenen eller sprer seg via de mesenteriske lymfeknuter inn i blodstrømmen, noe som fører til hematogen formidling til leveren og milt^6,7. I leveren og milten er bakterien i stand til å formidle opptak til både profesjonelle fagocytter så vel som bosatte parenchymale celler, og etablerer raskt infeksjoner i disse organene. Etter hvert som bakteriebelastningen øker, spres mange bakterier tilbake i blodet, hvor de er i stand til å kolonisere mottakelige vev ytterligere, inkludert sentralnervesystemet og morkaken (hvor de er til stede). Kolonisering av disse stedene utelukker de vanligste manifestasjonene av listeriose hos mennesker, inkludert meningitt, encefalitt og foster abort².

Utvalgte subpopulations av L. monocytogenes har nylig vist seg å ha en forbedret kapasitet til å invadere og replikere innenfor hjertevev⁸. Manifestasjoner av hjerteinvolvering er varierte, og spenner fra endokarditt og perikarditt, til fulminant myokarditt komplett med ledningsavvik^9-13. Det totale antallet L. monocytogenes hjertetilfeller per år er lavt, men kan være undervurdert, da denne fasetten av infeksjon generelt ikke er godt anerkjent. Kolonisering av hjertet av patogener krever ofte vertdisposisjoner som eksisterende valvulær skade eller kunstige hjerteklaffer. Det er imidlertid isolerer av L. monocytogenes som er identifisert som er kjent for deres evne til å kolonisere hjertene til infiserte dyr i fravær av hjerteskader og / eller abnormiteter⁸.

Her er beskrevet in vitro og in vivo metoder for å vurdere bakteriell kolonisering av hjertevev i infiserte dyr ved hjelp av invasjonsanalyser i vevskultur samt levende dyreinfeksjoner. Disse metodene har vist seg nyttige i ikke bare for å identifisere stammer med potensial til å kolonisere hjertevev hos infiserte dyr, men bør også være nyttige for identifisering av bakterielle genprodukter som tjener til å forbedre hjertecelleinvasjon og / eller resultere i endringer i hjertepatologi. Disse metodene letter sammenligningen av kardiotropisme mellom flere stammer. For metodene beskrevet her, L. monocytogenes 10403S brukes som en godt studert representant for en ikke-kardiotropisk stamme og den kliniske isolasjonen 07PF0776 brukes som et representativt eksempel på en kardiotropisk stamme. Disse to stammene ble valgt for å gi en sammenligning for bakteriell invasjon av hjerteceller in vitro og kolonisering av hjerter av infiserte mus in vivo. Den isolerende 07PF0776 er en klinisk isolerende gjenopprettet fra en interventricular abscess som forårsaket en dødelig arytmi hos en HIV + pasient⁸. L. monocytogenes isolerer kan variere i deres virulenspotensial, og gitt tilbøyelighet til listeria til å infisere personer med immunsuppresjon og gravide kvinner, bør personer i disse populasjonene utvise forsiktighet mens de vurderer ulike kliniske isolasjoner.

Protocol

1. Lagrings- og kulturforhold for L. monocytogenes stammer Forbered faste medier ved å autoklavere hjernehjerteinfusjonsagar (BHI) og hell det smeltede mediet i petriske plater. La platene tørke over natten ved romtemperatur, deretter over natten igjen ved 37 °C. Bruk en steril sløyfe, få en liten prøve av L. monocytogenes fra enten tidligere laget frysebestander (bakterier suspendert i 20% glyserol i BHI flytende medier, lagret ved -80 °C) eller fra en agarplate som inneholde…

Representative Results

Utvalgte isolasjoner av L. monocytogenes viser forbedret invasjon av hjerteceller i cellekultur og i musemodeller av infeksjon. Figur 1 viser et eksempel på hvordan bakteriekolonier kan oppstå etter spotbelegg av suspensjoner på agarmedier. Denne metoden tillater nøyaktig vurdering av CFUer i en prøve uten å bruke et stort antall agarmedieplater. Figur 2 viser et eksempel på en vevskulturbasert analyse som sammenligner evnen til stamme 10403S til å invadere hjerteceller …

Discussion

L. monocytogenes er et utbredt og godt karakterisert menneskelig patogen, som er i stand til å forårsake en rekke forskjellige sykdoms manifestasjoner¹⁵. Bakterien har tidligere blitt beskrevet for sin evne til å translokalisere på tvers av barrierer, for eksempel blod-hjerne-barriere og placental-foster barrierer, for å nå og kolonisere sentralnervesystemet og utvikle foster, henholdsvis. Organismens in vivo evne til å kolonisere disse vevene kompletteres ofte av en in vitro …

Materials

Difco	BHI Broth Base	237200	2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco	Agar	214510	2KG of Granulated Agar
Difco	BHI Agar	241810	2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen	LB Broth Base	12975-084	2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher	Glass Coverslips	12-545-80	12mm glass coverslips
Falcon	24-well Tissue Culture Plate	35-3047	24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon	14mL Polystyrene tube	352051	14mL Polystyrene tubes
Falcon	96-well U-bottom plate	35-3077	Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning	0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning	DMEM (High glucose, high pyruvate)	15-013-CU	DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning)	L-Glutamine	25005197	Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville	75cm^2 Flask	T1225	75cm^2 tissue culture treated flask
Denville	1.5mL microcentrifuge tubes	2013004	1.5mL microcentrifuge tubes
ATCC	H9c2 Cardiac Myoblasts	CRL-1446	Rat cardiac myoblasts
Hyclone	Fetal Bovine Serum	SH30070.63	Fetal Bovine Serum