Listeria monocytogenes forårsaker fosterinfeksjoner hos gravide kvinner og meningitt i utsatte populasjoner. Subpopulasjoner av bakterier kan kolonisere hjertevev, forårsaker myokarditt hos pasienter og laboratoriedyr. Her presenterer vi en protokoll som beskriver hvordan man vurderer L. monocytogenes hjertecelleinvasjon in vitro og hjertekolonisering hos smittede dyr.
Listeria monocytogenes er et Gram-positivt fakultets intracellulært patogen som er i stand til å forårsake alvorlige invasive infeksjoner hos immunkompromitterte pasienter, eldre og gravide kvinner. De vanligste manifestasjonene av listeriose hos mennesker inkluderer meningitt, encefalitt og fosterabort. En betydelig, men mye mindre dokumentert oppfølger av invasiv L. monocytogenes infeksjon involverer hjertet. Dødsraten fra hjertesykdom kan være opptil 35% til tross for behandling, men svært lite er kjent angående L. monocytogenes kolonisering av hjertevev og dets resulterende patologier. I tillegg har det nylig blitt tydelig at subpopulations av L. monocytogenes har en forbedret kapasitet til å invadere og vokse innen hjertevev. Denne protokollen beskriver i detalj in vitro- og in vivo-metoder som kan brukes til å vurdere kardiotropisme av L. monocytogenes isolerer. Metoder presenteres for infeksjon av H9c2 rotte hjerte myoblaster i vevskultur samt for bestemmelse av bakteriell kolonisering av hjertene til infiserte mus. Disse metodene er nyttige ikke bare for å identifisere stammer med potensial til å kolonisere hjertevev hos infiserte dyr, men kan også lette identifisering av bakterielle genprodukter som tjener til å forbedre hjertecelleinvasjon og / eller drive endringer i hjertepatologi. Disse metodene sørger også for direkte sammenligning av kardiotropisme mellom flere L. monocytogenes stammer.
Listeria monocytogenes er et Gram-positivt intracellulært patogen som er i stand til å forårsake alvorlig sykdom i utsatte populasjoner, inkludert eldre, gravide kvinner, personer med HIV / AIDS og personer som mottar kjemoterapi1. Infeksjon i disse populasjonene er ofte et resultat av inntak av forurensede matvarer, og de fleste infeksjoner er forbundet med store matbårne utbrudd2,3. Hos mennesker og andre pattedyr er L. monocytogenes i stand til å translokalisere over tynntarmens epitelgrense, og deretter transporteres til leveren4,5. Dyremodeller antyder at inntatte bakterier replikerer i tarm villi og transitt til leveren gjennom portalvenen eller sprer seg via de mesenteriske lymfeknuter inn i blodstrømmen, noe som fører til hematogen formidling til leveren og milt6,7. I leveren og milten er bakterien i stand til å formidle opptak til både profesjonelle fagocytter så vel som bosatte parenchymale celler, og etablerer raskt infeksjoner i disse organene. Etter hvert som bakteriebelastningen øker, spres mange bakterier tilbake i blodet, hvor de er i stand til å kolonisere mottakelige vev ytterligere, inkludert sentralnervesystemet og morkaken (hvor de er til stede). Kolonisering av disse stedene utelukker de vanligste manifestasjonene av listeriose hos mennesker, inkludert meningitt, encefalitt og foster abort2.
Utvalgte subpopulations av L. monocytogenes har nylig vist seg å ha en forbedret kapasitet til å invadere og replikere innenfor hjertevev8. Manifestasjoner av hjerteinvolvering er varierte, og spenner fra endokarditt og perikarditt, til fulminant myokarditt komplett med ledningsavvik9-13. Det totale antallet L. monocytogenes hjertetilfeller per år er lavt, men kan være undervurdert, da denne fasetten av infeksjon generelt ikke er godt anerkjent. Kolonisering av hjertet av patogener krever ofte vertdisposisjoner som eksisterende valvulær skade eller kunstige hjerteklaffer. Det er imidlertid isolerer av L. monocytogenes som er identifisert som er kjent for deres evne til å kolonisere hjertene til infiserte dyr i fravær av hjerteskader og / eller abnormiteter8.
Her er beskrevet in vitro og in vivo metoder for å vurdere bakteriell kolonisering av hjertevev i infiserte dyr ved hjelp av invasjonsanalyser i vevskultur samt levende dyreinfeksjoner. Disse metodene har vist seg nyttige i ikke bare for å identifisere stammer med potensial til å kolonisere hjertevev hos infiserte dyr, men bør også være nyttige for identifisering av bakterielle genprodukter som tjener til å forbedre hjertecelleinvasjon og / eller resultere i endringer i hjertepatologi. Disse metodene letter sammenligningen av kardiotropisme mellom flere stammer. For metodene beskrevet her, L. monocytogenes 10403S brukes som en godt studert representant for en ikke-kardiotropisk stamme og den kliniske isolasjonen 07PF0776 brukes som et representativt eksempel på en kardiotropisk stamme. Disse to stammene ble valgt for å gi en sammenligning for bakteriell invasjon av hjerteceller in vitro og kolonisering av hjerter av infiserte mus in vivo. Den isolerende 07PF0776 er en klinisk isolerende gjenopprettet fra en interventricular abscess som forårsaket en dødelig arytmi hos en HIV + pasient8. L. monocytogenes isolerer kan variere i deres virulenspotensial, og gitt tilbøyelighet til listeria til å infisere personer med immunsuppresjon og gravide kvinner, bør personer i disse populasjonene utvise forsiktighet mens de vurderer ulike kliniske isolasjoner.
L. monocytogenes er et utbredt og godt karakterisert menneskelig patogen, som er i stand til å forårsake en rekke forskjellige sykdoms manifestasjoner15. Bakterien har tidligere blitt beskrevet for sin evne til å translokalisere på tvers av barrierer, for eksempel blod-hjerne-barriere og placental-foster barrierer, for å nå og kolonisere sentralnervesystemet og utvikle foster, henholdsvis. Organismens in vivo evne til å kolonisere disse vevene kompletteres ofte av en in vitro …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Public Health Service tilskudd AI41816 og AI099339 (N.E.F.) og av F31AI094886-01 (P.D.M.) fra NIAID. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til finansieringskildene.
Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
Difco | Agar | 214510 | 2KG of Granulated Agar |
Difco | BHI Agar | 241810 | 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar) |
Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12mm glass coverslips |
Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14mL Polystyrene tubes |
Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75cm^2 tissue culture treated flask |
Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5mL microcentrifuge tubes |
ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |