Her rapporterer vi dobbel merking av nevrale kamceller og blodårer ved hjelp av kyllingGFP neural tube intraspecies podning kombinert med intra-vaskulær DiI injeksjon. Denne eksperimentelle teknikken lar oss samtidig visualisere og studere utviklingen av det NCC-avledede (enteriske) nervesystemet og det vaskulære systemet, under organogenese.
Alle utviklende organer må kobles til både nervesystemet (for sensorisk og motorisk kontroll) samt det vaskulære systemet (for gassutveksling, væske- og næringsforsyning). Følgelig utvikler både de nervøse og vaskulære systemene seg sammen og deler slående likheter i forgreningsarkitekturen. Her rapporterer vi embryonale manipulasjoner som lar oss studere samtidig utvikling av nevralt kam-avledet nervevev (i dette tilfellet det enteriske nervesystemet) og det vaskulære systemet. Dette oppnås ved å generere kylling chimeras via transplantasjon av diskrete segmenter av nevralrøret, og tilhørende nevral kam, kombinert med vaskulær DiI-injeksjon i samme embryo. Vår metode bruker transgen kyllingGFP embryoer for intraspecies podning, noe som gjør transplantasjonsteknikken kraftigere enn den klassiske vaktel-chick interspecies podningsprotokollen som brukes med stor effekt siden 1970-tallet. ChickGFP-chick intraspecies podning letter avbildning av transplanterte celler og deres projeksjoner i intakt vev, og eliminerer eventuelle skjevheter i celleutvikling knyttet til artsforskjeller. Denne metoden drar full nytte av enkel tilgang til fugleembryoet (sammenlignet med andre virveldyrembryoer) for å studere samutviklingen av det enteriske nervesystemet og det vaskulære systemet.
Kyllingembryoet er en uvurderlig modellorganisme i virveldyrutviklingsbiologi, ikke minst fordi utviklingen i ovo tillater eksperimentelle manipulasjoner som ellers er umulige å utføre i vertebrater som utvikler seg i utero. Denne tilgjengeligheten og enkel manipulasjon har ført til at kyllingembryoet spiller nøkkelroller i mange seminalfunn innen utviklingsbiologi. Blant de kraftigste teknikkene har vært bruk av vaktelkylling chimeric embryoer for å studere celle skjebne, en metode pioner av professor Nicole Le Douarin i 1970-tallet1-3. Spesielt har vaktel-chick chimeras vært spesielt nyttig for å genetisk markere og følge svært trekkende nevrale kamcellepopulasjoner (NCC) under tidlig utvikling. NCC er en multipotent populasjon av trekkceller, som oppstår i dorsal ektoderm ved marginene i nevralrøret, som gir opphav til et bredt spekter av celletyper gjennom vertebratembryoet. Disse inkluderer kraniofaciale strukturer (brusk, bein, muskler), nevroner og glia (i sensoriske og autonome nervesystemer), melanocytter og en subpopulasjon av celler i det endokrine systemet2,4,5. En av de viktigste faktorene som påvirker NCC-skjebnen er deres opprinnelige plassering langs den fremre bakre aksen til nevralrøret. For eksempel oppstår enterisk NCC, som gir opphav til nevronene og glia i det enteriske nervesystemet (ENS), fra to diskrete underpopulasjoner: den første som ligger i vagal (kaudal hindbrain) -regionen, og den andre i sakralområdet i nevralrøret6-13. Inter eller intra-arter podning av de tilsvarende områdene i nevralrøret har vært de valgte teknikkene for å permanent merke disse cellene og deretter tillate sporing, fra fødselen på marginene i nevralrøret, til deres endelige destinasjoner i fordøyelseskanalen6,7,10.
En annen embryonal manipulasjon lettere å utføre hos kyllinger, sammenlignet med andre dyremodeller, er den vitale merkingen av det vaskulære systemet. Faktisk, som kyllingembryoet utvikler seg, ligger det på toppen av et ekstra embryonalt vaskulært nettverk som sirkulerer oksygen og næringsstoffer fra eggeplommen. Dette tilgjengelige vaskulære nettverket, som ligger på overflaten av eggeplommen, kan brukes som en inngangsport for å merke embryoets utviklende vaskulære system under organogenese12,14-17. Intravaskulær injeksjon av ulike fargestoffer, som lipofil fargestoff diI, gjør det mulig å avgrense / flekke alle de luminiserte karene i det nascent vaskulære nettverket.
Fordi utviklende organer må kobles til både nervesystemet (for sensorisk og motorisk kontroll) samt det vaskulære systemet (for gassutveksling, væske- og næringsforsyning), utvikler de to nettverkene sammen og deler slående likheter i forgreningsarkitekturen18-20. Her rapporterer vi embryonale manipulasjoner som gjør at vi kan studere samtidig utvikling av den NCC-avledede ENS, sammen med det vaskulære systemet, under organogenese. Dette oppnås ved å generere kylling chimeras via transplantasjon av diskrete segmenter av nevralrøret, inkludert nevral kam, kombinert med vaskulær DiI injeksjon. Som et fremskritt fra vaktel-kylling chimeras, bruker vår metode transgene GFP chick embryoer for intraspecies podning, noe som gjør transplantasjonsteknikken kraftigere, når det gjelder bildeceller og deres projeksjoner, og eliminerer potensielle skjevheter knyttet til artsforskjeller.
Metoden for intraspecies neural tube podning, kombinert med blodkarmerking beskrevet her, utnytter den enkle tilgangen til fugleembryoet i egget (sammenlignet med andre virveldyrembryoer) for å studere samutviklingen av et element i det autonome nervesystemet (ENS) og det vaskulære systemet.
For merking av NCC-derivater har kyllingenGFP-chick intraspecies podningsmetoden vi beskriver en rekke fordeler i forhold til den klassiske vaktelkylling chimera-metoden som ble etablert for over 40 år siden1-3. For det første, under FITC-lys, er GFP-fluorescens ekstremt lys, i den grad at GFP + celler er lett merkbare i levende chimeriske embryoer. Dette gjør at podatets suksess kan kontrolleres i ovo, mens vaktel-kylling podning krever at embryoet blir drept, behandlet og immunostert ved hjelp av QCPN, før graftets suksess kan fastslås2. For det andre er GFP-uttrykket i den transgene kyllingenGFP cytoplasmisk, derfor merker det ikke bare cellelegemer, men gjør det også mulig å visualisere fremspringene til de transplanterte cellene22. Dette tillater at intrikate nevronnettverk observeres ved høy oppløsning (merk at fine projeksjoner best visualiseres når prøven er immunostained med anti-GFP antistoff). Siden QCPN-merking er begrenset til vaktelcellekjernen, avsløres ikke slike nettverk ved hjelp av vaktel-kylling chimeras. For det tredje eliminerer intraspecies podning eventuelle artsforskjeller mellom celler i det chimeriske embryoet. Siden vaktelegg embryoer har en kortere inkubasjonsperiode enn kylling (19 dager versus 21 dager) har det blitt antydet at vaktelceller har en høyere spredningshastighet enn kyllingceller, noe som potensielt kan påvirke utviklingen av det chimeriske vevet23. Interessant nok har det også blitt vist i planter at interspecies podning kan produsere omfattende endringer i DNA-metyleringsmønstre i verten 24. For det fjerde legger chickGFP til rette for ryggtransplantasjonseksperimenter for å ta opp emner som NCC-skjebne og celleforpliktelse25. For det femte er den transgenekyllingen GFP også nyttig for mange andre teknikker, inkludert FACS-sortering av GFP + celle subpopulations, organotypisk kultur av organer som inneholder GFP + celler, genetisk manipulering av GFP + podet vev via elektroporasjon av uttrykk plasmider26, og andre bildeteknologier som optisk projeksjon tomografi27.
Neural tube transplantasjon tilnærming kan endres ved mikrokirurgisk erstatte kortere mengder neural tube. Ved å bruke mindre segmenter av nevralrør er mikrokirurgien potensielt mindre skadelig for embryoet, og overlevelsen kan forbedres. Ulempen med å transplantere mindre nevralt rør er imidlertid at antallet GFP + NCC i verten vil bli redusert. Brukere kan prøve å oppnå en balanse mellom mengden nevralrør transplantert for å gi optimal overlevelse av embryoer, og antall GFP + NCC innen vertstarmen tilstrekkelig til å gi informative resultater.
For fartøymaling har DiI fordelen at fluorescensen er veldig lys og robust. Den har også kapasitet til å spre seg under fiksering som forsikrer farging av de fineste åpnede kapillærene. Siden det er et viktig fargestoff, kan embryoer overleve injeksjonsprosedyren og fortsette å utvikle seg med et farget vaskulært system (opptil 24 timer i våre hender, selv om fargingen blir mer punktlig over tid, se figur 3E). Kombinasjonen av kyllingGFP-podning med DiI vaskulært maleri er derfor kompatibel med levende avbildning. Foruten alle disse fordelene, er det viktig å merke seg at vaskulær injeksjon bare merker luminiserte kar og derfor ikke identifiserer uåpnede kapillærer, endotelceller eller isolerte endotelceller. Videre fremgang i fugletransgenese kan imidlertid gi nye måter å omgå slike problemer på, som eksemplifisert ved eksperimenter ved hjelp av Tg(tie1:H2B-eYFP) vaktelembryoer for å studere vaskulær morfogenese28. En annen begrensning ved denne teknikken er at for effektiv fartøymerking i embryoer på E7,5 og utover, må større mengder fargestoff injiseres, noe som kan gjøre eksperimenter dyre. En modifikasjon av teknikken kan imidlertid omfatte lavpris blodkar merkingusing highlighter blekk14, selv om denne tilnærmingen ikke har blitt prøvd i våre hender.
Kritiske trinn i prosedyrene inkluderer prosessen med å visualisere embryoet ved å injisere blekk under blastodisc. Hvis membranen som dekker eggeplommen blir revet av den blekkfylte nålen på dette stadiet, blir embryooverlevelse alvorlig kompromittert. Det er også viktig, når du forbereder en donor nevral tube, at vevet ikke er igjen i altfor lang tid i bukspyttkjertelen (vurder ca. 10 min som maksimum). Langvarig eksponering for pankreatin skader vevet og nevralrøret er da vanskelig å håndtere, og det vil ikke innlemme godt i verten. Å få erfaring med DiI-injeksjonsteknikken på embryoer av vill type er viktig før injisering av chimeriske embryoer, da bare ett forsøk på injeksjon generelt er mulig for hvert embryo. DiI-volum og nåleediameter er kritiske parametere for hvert embryo og bør vurderes på vill type, trinntilpassede kontroller.
Til slutt kan vår doble merkingsmetode for nevral rørtransplantasjon og DiI-karmaling i levende kyllingembryoer brukes til å undersøke sammenhengene mellom NCC og blodkarnettverk under organogenese. Tatt i betraktning mekanismene som er ansvarlige for å etablere riktig mål innervering og vaskularisering under organutvikling, er fortsatt stort sett ukjent, har denne metodikken potensial for fremtidige funn på dette feltet.
The authors have nothing to disclose.
Befruktede GFP kyllingegg ble levert av prof. Helen Sang, The Roslin Institute og University of Edinburgh, UK. Roslin Transgenic Chicken Facility er finansiert av Wellcome Trust og av Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC). Arbeidet ble delvis finansiert, og NT støttet, av Great Ormond Street Hospital Children’s Charity, London, UK. Forfatterne takker Ben Jevans, UCL Institute of Child Health, for hjelp til å forberede embryoer for podning.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
Fertilised chick eggs | Henry Stewart and Co, Louth, UK | |
Fertilised GFP chick eggs | The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh | |
Egg incubator (Profi-H Hatcher) | Lyon Technologies, CA, USA | 910-033 |
14C Incubator | Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK | Model LT2 |
Stereo-microscope | LEICA | Model MZ 12.5 |
Digital Camera | LEICA | DC500 |
Image acquisition software | LEICA | IM50 |
Goose neck halogen cold light source | Advanced Imaging Concepts, Inc | KL 1500 LCD |
181⁄2 G hypodermic needle | SIGMA – ALDRICH | HSWNH181 |
Pancreatin | SIGMA – ALDRICH | P3292 |
DMEM | SIGMA – ALDRICH | D5030 |
Goat serum | SIGMA – ALDRICH | G6767 |
5ml syringe | SIGMA – ALDRICH | Z248010 |
Mouth tube | SIGMA – ALDRICH | A5177 |
Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in. | SIGMA – ALDRICH | S6018 |
Transfer pipettes, polyethylene | SIGMA – ALDRICH | Z350796 |
Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament | Harvard apparatus | PY8 30-0035 |
Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 |
Curved Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14059-09 |
Needle holders (Nickel-plated pin holder) | Fine Science Tools | 26018-17 |
Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 |
Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated | Fine Science Tools | 11210-10 |
Perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-18 |
Tungsten needles (0.125mm diameter) | Fine Science Tools | 10130-05 |
Sellotape (clear, 24mm width) | Any Supplier | |
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution | VWR international | 101447-068 |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | S09 512 516 |
Pelikan black ink | Pelikan | 211-169 |
CellTracker CM-DiI | Molecular Probes | C-7001 |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 |
Settings for glass needle puller | Sutter Instruments | Flaming/Brown micropipette puller model P-86 |
Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500 |