Här rapporterar vi dubbel märkning av neurala vapenceller och blodkärl med hjälp av chickGFP neuralrör intraspecies ympning kombinerat med intra-vaskulär DiI injektion. Denna experimentella teknik gör det möjligt för oss att samtidigt visualisera och studera utvecklingen av det NCC-härledda (enteriska) nervsystemet och kärlsystemet, under organogenes.
Alla utvecklande organ måste anslutas till både nervsystemet (för sensorisk och motorisk kontroll) samt kärlsystemet (för gasutbyte, vätska och näringstillförsel). Följaktligen utvecklas både de nervösa och kärlsystemen tillsammans och delar slående likheter i sin förgrenande arkitektur. Här rapporterar vi embryonala manipuleringar som gör det möjligt för oss att studera den samtidiga utvecklingen av neurala vapen-härledda nervvävnad (i detta fall enteriska nervsystemet) och kärlsystemet. Detta uppnås genom att generera kyckling chimeras via transplantation av diskreta segment av neurala röret, och tillhörande neurala vapen, kombinerat med vaskulär DiI injektion i samma embryo. Vår metod använder transgenaGFP-embryon för intraspecies ympning, vilket gör transplantationstekniken kraftfullare än det klassiska vaktel-chick interspecies ympning protokollet som används med stor effekt sedan 1970-talet. ChickGFP-chick intraspecies ympning underlättar avbildning av transplanterade celler och deras projektioner i intakta vävnader, och eliminerar eventuella fördomar i cellutveckling kopplad till artskillnader. Denna metod drar full nytta av hur lätt det är att komma åt fågelembryon (jämfört med andra embryon från ryggradsdjur) för att studera samutvecklingen av det enteriska nervsystemet och kärlsystemet.
Kycklingembryon är en ovärderlig modellorganism inom ryggradsdjursutvecklingsbiologi, inte minst eftersom dess utveckling i ovo tillåter experimentella manipuleringar som annars är omöjliga att utföra hos ryggradsdjur som utvecklas in utero. Denna tillgänglighet och lätthet i manipuleringar har lett till att kycklingembryon spelar nyckelroller i många viktiga upptäckter inom utvecklingsbiologin. Bland de mest kraftfulla teknikerna har varit användningen av vaktel-chick chimeric embryon för att studera cell ödet, en metod som banade väg för professor Nicole Le Douarin på 1970-talet1-3. I synnerhet har vaktel-chick chimeras varit särskilt användbara för att genetiskt markera och följa högvandrande neurala vapencellspopulationer (NCC) under tidig utveckling. NCC är en multipotent population av flyttande celler, som uppstår i dorsala ectoderm i utkanten av neuralröret, som ger upphov till ett brett spektrum av celltyper i hela ryggradsdjursembryon. Dessa inkluderar kraniofacial strukturer (brosk, ben, muskler), nervceller och glia (i sensoriska och autonoma nervsystemet), melanocyter och en subpopulation av celler i det endokrina systemet2,4,5. En av de viktigaste faktorerna som påverkar NCC:s öde är deras ursprungliga placering längs neuralrörets främre bakre axel. Till exempel uppstår enteriska NCC, som ger upphov till nervceller och glia i det enteriska nervsystemet (ENS), från två diskreta underpopulationer: den första belägen i vagal (kaudal bakhjärna) regionen och den andra i sakrala regionen av neuralröret6-13. Ympning av motsvarande regioner i neuralröret har varit den teknik som har valts för att permanent märka dessa celler och därefter tillåta spårning, från deras födelse i neuralrörets marginaler, till deras slutdestinationer inommag-tarmkanalen 6,7,10.
En annan embryonal manipulation som är lättare att utföra hos kyckling, jämfört med andra djurmodeller, är den vitala märkningen av kärlsystemet. När kycklingembryon utvecklas ligger det faktiskt ovanpå ett utom embryonalt kärlnätverk som cirkulerar syre och näringsämnen från äggulan. Detta tillgängliga kärlnätverk, som ligger på äggulans yta, kan användas som en inkörsport för att märka embryots utvecklande kärlsystem under organogenesis12,14-17. Intravaskulär injektion av olika färgämnen, såsom lipofila färgämne DiI, gör det möjligt att avgränsa/fläcka alla luminiserade kärl i det gryende kärlnätverket.
Eftersom utvecklande organ måste anslutas till både nervsystemet (för sensorisk och motorisk kontroll) samt kärlsystemet (för gasutbyte, vätske- och näringstillförsel), utvecklas de två nätverken tillsammans och delar slående likheter i sin förgrenandearkitektur 18-20. Här rapporterar vi embryonala manipuleringar som gör det möjligt för oss att studera den samtidiga utvecklingen av NCC-härledda ENS, tillsammans med kärlsystemet, under organogenes. Detta uppnås genom att generera kyckling chimeras via transplantation av diskreta segment av neurala röret, inklusive neurala krönet, kombinerat med vaskulär DiI injektion. Som ett framsteg från vaktel-kyckling chimeras använder vår metod transgena GFP-kycklingembryon för intraspecies ympning, vilket gör transplantationstekniken kraftfullare, när det gäller bildceller och deras projektioner, och eliminerar eventuella fördomar kopplade till artskillnader.
Metoden för intraspecies neuralrör ympning, i kombination med blodkärl märkning beskrivs här, drar full nytta av enkel tillgång till fågel embryot i ägget (jämfört med andra ryggradsdjur embryon) att studera samutvecklingen av ett element i det autonoma nervsystemet (ENS) och kärlsystemet.
För märkning av NCC-derivat harchick GFP-chickintraspecies ympningsmetod som vi beskriver ett antal fördelar jämfört med den klassiska vaktel-chick chimera-metoden som etablerades för över 40 år sedan1-3. För det första, under FITC-ljus, är GFP-fluorescens extremt ljus, i den utsträckning som GFP + celler lätt kan urskiljas i levande chimeriska embryon. Detta gör det möjligt att kontrollera transplantatets framgång i ovo, medan vaktel-chick ympning kräver att embryot avlivas, bearbetas och immunostained med QCPN, innan transplantatets framgång kan fastställas2. För det andra är GFP-uttrycket hos den transgenakycklingen GFP cytoplasmiskt, därför märker det inte bara cellkroppar utan gör det också möjligt att visualisera projektionerna av de transplanteradecellerna 22. Detta gör det möjligt att observera invecklade neuronala nätverk med hög upplösning (observera att fina projektioner bäst visualiseras när provet är immunostained med anti-GFP antikroppar). Eftersom QCPN-märkning är begränsad till vaktecellskärnan, avslöjas inte sådana nätverk med vaktel-chick chimeras. För det tredje eliminerar ympning inomarter eventuella artskillnader mellan celler i det chimeriska embryot. Eftersom vaktebryon har en kortare inkubationstid än kyckling (19 dagar jämfört med 21 dagar) har det föreslagits att vaktelceller har en högre spridningshastighet än kycklingceller, vilket potentiellt kan påverka utvecklingen av de chimeriskavävnaderna 23. Intressant nog har det också visat sig i växter att interspecies ympning kan producera omfattande förändringar i DNA metylering mönster i värden 24. För det fjärde underlättarchick GFP backtransplantationsexperiment för att ta itu med ämnen som NCC-öde och cellåtagande25. För det femte är den transgenakycklingen GFP också användbar för många andra tekniker, inklusive FACS-sortering av GFP + cell subpopulationer, organotypisk kultur av organ som innehåller GFP + celler, genetisk manipulering av GFP + ympad vävnad via elektroporering av uttrycksplasmider26, och andra bildteknik som optisk projektionstomografi27.
Neuralrörstransplantationsmetoden kan modifieras genom att mikrosurgiskt ersätta kortare mängder neuralrör. Genom att använda mindre segment av neuralrör är mikrokirurgin potentiellt mindre skadlig för embryot och överlevnaden kan förbättras. Nackdelen med att transplantera mindre neuralrör är dock att antalet GFP + NCC i värden kommer att minskas. Användare kan försöka uppnå en balans mellan mängden neuralrör som transplanteras för att ge optimal överlevnad av embryon, och antalet GFP + NCC i värdtarmen tillräckligt för att ge informativa resultat.
För kärlmålning har DiI fördelen att dess fluorescens är mycket ljus och robust. Den har också kapacitet att sprida sig under fixeringsdiftering och säkerställa färgning av de finaste öppnade kapillärerna. Eftersom det är ett viktigt färgämne kan embryon överleva injektionsproceduren och fortsätta utvecklas med ett färgat kärlsystem (upp till 24 timmar i våra händer, även om färgningen blir mer punktlig med tiden, se figur 3E). Kombinationen av chickGFP ympning med DiI vaskulär målning är därför kompatibel med levande bildbehandling. Förutom alla dessa fördelar är det viktigt att notera att vaskulär injektion endast märker luminiserade kärl och därför inte identifierar oöppnade kapillärer, endotelspetsceller eller isolerade endotelceller. Ytterligare framsteg inom fågeltransgenes skulle dock kunna ge nya sätt att kringgå sådana problem, vilket exemplifieras av experiment med Tg(tie1:H2B-eYFP) vaktembryon för att studera vaskulär morfogenesis28. En annan begränsning av denna teknik är att för effektiv kärlmärkning i embryon vid E7.5 och därefter måste större mängder färg injiceras, vilket kan göra experiment dyra. En modifiering av tekniken kan dock inkludera lågkostnads blodkärl märkningusing highlighter bläck14, även om detta tillvägagångssätt inte har provats i våra händer.
Kritiska steg i procedurerna inkluderar processen att visualisera embryot genom att injicera bläck under blastodisc. Om membranet som täcker äggulan slits av den bläckfyllda nålen i detta skede äventyras embryoöverlevnaden allvarligt. Det är också viktigt, när man förbereder ett donator neuralrör, att vävnaden inte lämnas under en alltför lång tid i bukspottkörtel (överväga ungefär 10 min som ett maximum). Långvarig exponering för bukspottkörtel skadar vävnaden och neuralröret är då svårt att hantera och det kommer inte att införlivas väl i värden. Att få erfarenhet av DiI-injektionstekniken på embryon av vildtyp är viktigt innan du injicerar chimeriska embryon, eftersom endast ett försök att injicera i allmänhet är möjligt för varje embryo. DiI-volym och nåldiameter är kritiska parametrar för varje embryo och bör bedömas på vilda, stegmatchade kontroller.
Sammanfattningsvis kan vår dubbla märkningsmetod för neuralrörstransplantation och DiI-kärlmålning i levande kycklingembryon användas för att undersöka sambanden mellan NCC och blodkärlsnätverk under organogenes. Med tanke på de mekanismer som ansvarar för att fastställa rätt mål innervation och vascularization under organ utveckling är fortfarande till stor del okända, denna metodik har potential för framtida upptäckter inom detta område.
The authors have nothing to disclose.
Befruktade GFP-kycklingägg levererades av professor Helen Sang, Roslin Institute och University of Edinburgh, Storbritannien. Roslin Transgenic Chicken Facility finansieras av Wellcome Trust och av Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC). Arbetet finansierades delvis, och NT stöddes, av Great Ormond Street Hospital Children’s Charity, London, Storbritannien. Författarna tackar Ben Jevans, UCL Institute of Child Health, för hjälp med att förbereda embryon för ympning.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
Fertilised chick eggs | Henry Stewart and Co, Louth, UK | |
Fertilised GFP chick eggs | The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh | |
Egg incubator (Profi-H Hatcher) | Lyon Technologies, CA, USA | 910-033 |
14C Incubator | Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK | Model LT2 |
Stereo-microscope | LEICA | Model MZ 12.5 |
Digital Camera | LEICA | DC500 |
Image acquisition software | LEICA | IM50 |
Goose neck halogen cold light source | Advanced Imaging Concepts, Inc | KL 1500 LCD |
181⁄2 G hypodermic needle | SIGMA – ALDRICH | HSWNH181 |
Pancreatin | SIGMA – ALDRICH | P3292 |
DMEM | SIGMA – ALDRICH | D5030 |
Goat serum | SIGMA – ALDRICH | G6767 |
5ml syringe | SIGMA – ALDRICH | Z248010 |
Mouth tube | SIGMA – ALDRICH | A5177 |
Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in. | SIGMA – ALDRICH | S6018 |
Transfer pipettes, polyethylene | SIGMA – ALDRICH | Z350796 |
Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament | Harvard apparatus | PY8 30-0035 |
Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 |
Curved Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14059-09 |
Needle holders (Nickel-plated pin holder) | Fine Science Tools | 26018-17 |
Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 |
Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated | Fine Science Tools | 11210-10 |
Perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-18 |
Tungsten needles (0.125mm diameter) | Fine Science Tools | 10130-05 |
Sellotape (clear, 24mm width) | Any Supplier | |
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution | VWR international | 101447-068 |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | S09 512 516 |
Pelikan black ink | Pelikan | 211-169 |
CellTracker CM-DiI | Molecular Probes | C-7001 |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 |
Settings for glass needle puller | Sutter Instruments | Flaming/Brown micropipette puller model P-86 |
Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500 |