Bioconjugation וRadiosynthesis של⁸⁹ נוגדנים שכותרתו ZR-DFO

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

הזיקה, סגוליות, והסלקטיביות יוצאות דופן של נוגדנים להפוך אותם וקטורים בצורה יוצאת דופן אטרקטיביים לרדיואקטיביות PET-ממוקד של גידול. בשל זמן מחצית החיים הביולוגיים רב-היום שלהם, נוגדנים חייבים להיות מסומנים עם radionuclides פולטות פוזיטרונים עם זמן מחצית חי ריקבון פיזי ארוכים יחסית. באופן מסורתי, איזוטופים פולטות פוזיטרונים ¹²⁴ אני (t _1/2 = 4.18 ד), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14.7 שעות), ו- ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12.7 שעות) שימשו לתייג נוגדנים ל ההדמיה PET. לאחרונה, עם זאת, השדה יש עדים עלייה דרמטית בשימוש בradiometal ⁸⁹ Zr פולטות פוזיטרונים בסוכני הדמיה PET מבוסס נוגדן. ⁸⁹ Zr הוא רדיו-איזוטופי כמעט אידיאלי להדמית PET עם immunoconjugates, כפי שהיא בעל מחצית פיזית -life (t _1/2 = 78.4 שעות), כי הוא תואם את הפרמקוקינטיקה in vivo של נוגדנים ופולט ENE נמוכה יחסיתפוזיטרונים rgy שמייצר תמונות ברזולוציה גבוהות. יתר על כן, נוגדנים יכולים להיות מתויגים בצורה ישירה עם ⁸⁹ Zr באמצעות desferrioxamine-נגזר siderophore chelator (DFO). בפרוטוקול זה, J591 נוגדן אנטיגן קרום המיקוד ספציפי לערמונית ישמש כמערכת מודל להמחשה (1) bioconjugation של chelator bifunctional DFO-isothiocyanate לנוגדן, (2) radiosynthesis והטיהור של ⁸⁹ Zr- radioimmunoconjugate DFO-מב, ו (3) in vivo הדמיה PET עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב ⁸⁹ במודל עכברי של הסרטן.

Introduction

בשל רגישותם הראויה לציון, זיקה, וסלקטיביות, נוגדנים כבר מזמן נחשבים וקטורים מבטיחים עבור המשלוח של רדיואיזוטופים לתאים סרטניים. עם זאת, היישום שלהם בטומוגרפיה פליטת פוזיטרונים הדמיה (PET) כבר הקשו על ידי חוסר רדיו-איזוטופי פולטות פוזיטרונים מתאים לתיוג שלהם. ^1-3 אחד השיקולים החשובים ביותר בעיצוב של radioimmunoconjugates הוא התאמת הריקבון הפיזי חצי חיים של הרדיו-איזוטופי לin vivo הפרמקוקינטיקה של הנוגדן. באופן ספציפי יותר, לעתים קרובות יש נוגדנים זמן מחצית חיים ביולוגיים ארוכים יחסית, רב היום, ולכן הוא חייב להיות מסומן עם רדיואיזוטופים עם זמן מחצית חיים פיזיים דומים. עבור יישומי הדמיה PET, נוגדנים היו radiolabeled באופן מסורתי עם ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12.7 שעות), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14.7 שעות), או ¹²⁴ אני (t _1/2 = 4.18 ד). ^{4, 5} עם זאת, כל אחד מרדיואיזוטופים אלה בעל מגבלות משמעותיות שתפגענה בהתאמתם להדמיה קלינית. בעוד radioimmunoconjugates שכותרתו עם ⁸⁶ Y ו- ⁶⁴ Cu הוכיח מבטיח בחקירות פרה-קליניים, שני איזוטופים בעלי זמן מחצית חיים פיזיים כי הם קצרים מכדי להיות יעילים עבור הדמיה בבני אדם. ¹²⁴ אני, לעומת זאת, יש לו זמן מחצית חיים פיזיים כמעט אידיאליים ל הדמיה עם נוגדנים, אבל זה יקר ויש לו מאפייני ריקבון הכי מוצלחים שיובילו לרזולוציה נמוכה יחסית תמונות קליניות. יתר על כן, ¹²⁴ radioimmunoconjugates שכותרתו אני יכול להיות כפוף לdehalogenation in vivo, תהליך שיכול להוריד את יחסי פעילות גידול לרקע. ^6,7

הכונן למצוא רדיו-איזוטופי פולטות פוזיטרונים להחליף ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y, ואני ¹²⁴ בradioimmunoconjugates הזין את העליות האחרונות במחקר על ⁸⁹ נוגדני Zr כותרת. ^8-12 Tהוא הסיבה להופעתו של ⁸⁹ Zr היא פשוטה: radiometal בעל כימי כמעט אידיאליים ותכונות פיזיות לשימוש בradioimmunoconjugates PET אבחון ^{13 89} Zr מופק באמצעות ⁸⁹ Y (p, n) ⁸⁹ תגובת Zr על מאיץ חלקיקים באמצעות. זמין מסחרי ויעד Y ⁸⁹ 100% טבעיים בשפע. ^14,15 radiometal יש תשואת פוזיטרונים של 23%, דועך עם זמן מחצית חיים של 78.4 שעות, ופולט פוזיטרונים עם האנרגיה נמוכה יחסית של 395.5 keV (איור 1). ^13,16,17 זה חשוב לציין כי ⁸⁹ Zr גם פולט אנרגיה גבוהה, 909 keV γ-ray עם יעילות של 99%. בעוד פליטה זה לא מפריעה במרץ עם 511 פוטונים הנפלטים keV, זה דורש שיקול נוסף בכל קשור לתחבורה, טיפול, וdosimetry. למרות אזהרה זו, מאפיינים אלה ריקבון סופו של דבר אומר שיש ⁸⁹ Zr h נוח יותר לא רקalf-חיים להדמיה עם נוגדנים מ ^-86 Y ו- ⁶⁴ Cu, אלא גם יכול לייצר תמונות ברזולוציה גבוהות יותר מאשר ¹²⁴ אני, אשר פולט פוזיטרונים עם אנרגיות גבוהות של 687 ו 975 keV כמו גם מספר הפוטונים עם אנרגיות בתוך 100-150 keV של הפוטונים שנוצרו פוזיטרונים 511 קאב. ¹³ יתר על כן, ⁸⁹ Zr הוא גם בטוח יותר לטפל, פחות יקר לייצר, וresidualizes בגידולים באופן יעיל יותר מאשר עמיתו יוד רדיואקטיבי. ^18,19 אחת הגבלת פוטנציאל של ⁸⁹ Zr היא שזה לא שיש לי איזוטופולוג טיפולי, למשל, ⁸⁶ Y (PET) לעומת ⁹⁰ Y (טיפול). זה מונע את בנייתם ​​של סוכנים זהים מבחינה כימית, פונדקאיות הדמיה שיכולה להיות מועסק כגששים מדי מינון לעמיתים הטיפוליים שלהם. שאמרו, החקירות מצביעות על כך שיש לי פוטנציאלי כממלאי מקום להדמיה ⁹⁰ א- ו ^-177 immunoconjugates כותרת Lu ⁸⁹ נוגדנים Zr שכותרתו.^20,21

מבחינה כימית, כמו מתכת הקבוצה IV, ⁸⁹ Zr קיים כקטיון +4 בתמיסה מימית. יון ⁴⁺ Zr טעון מאוד, (רדיוס אפקטיבי יוני = 0.84 א) גדול יחסית, ויכול להיות מסווג כקטיון "קשה". ככזה, הוא מציג העדפת ligands נושאות עד שמונה תורמי חמצן קשים, אניוני. בקלות chelator הנפוץ ביותר בשימוש בradioimmunoconjugates ⁸⁹ שכותרתו Zr הוא desferrioxamine (DFO),, chelator אציקליים-נגזר siderophore נושאת שלוש קבוצות hydroxamate. יגנד ביציבות מרכז את קטיון Zr ⁴⁺ במהירות ובצורה נקיה ב RT ברמות pH רלוונטיים מבחינה ביולוגית, ומורכב ZR-DFO וכתוצאה מכך נותר יציב במהלך מספר ימים במלח, בסרום דם, וכל דם. ²² מחקרים חישובית ממליצים שDFO טפסים מורכב hexacoordinate עם Zr ⁴⁺ בי מרכז המתכת מתואם לneut שלושRAL ושלושה תורמי anionic חמצן של יגנד, כמו גם שתי מולקולות מים אקסוגניים (איור 2). ^23,24 ההתנהגות של radioimmunoconjugates העסקת פיגום נטיית ⁸⁹ ZR-DFO in vivo באופן כללי היה מצוין. עם זאת, במקרים מסוימים, הדמיה ומחקרי biodistribution חריפים חשפו רמות גבוהות פעילות בעצמות של עכברים שהוזרקו עם ⁸⁹ נוגדני Zr שכותרתו, נתונים שמצביעים על כך שosteophilic ⁸⁹ Zr ⁴⁺ קטיון הוא שוחרר מchelator in vivo ולאחר מכן mineralizes בעצמות. ²⁵ לאחרונה, מספר החקירות לתוך הפיתוח של רומן ⁸⁹ chelators Zr ⁴⁺ במיוחד ligands עם שמונה תורמי חמצן הופיעו בספרות. ^24,26,27 עם זאת, כיום, DFO הוא chelator המועסק באופן נרחב ביותר ב ^-89 ZR-כותרת radioimmunoconjugates בהפרש גדול. מגוון שונהאסטרטגיות bioconjugation להיות מועסקים לצרף DFO לנוגדנים, כוללים כימיה bioorthogonal לחץ, התגובה של DFO תיאול-reactive בונה עם cysteines בנוגדן, והתגובה של מופעל DFO נושאי אסתר בונה עם lysines בנוגדן. ^{4,28- 30} בקלות את האסטרטגיה הנפוצה ביותר, עם זאת, היו השימוש בנגזרי isothiocyanate נושאות של DFO, DFO-NCS (איור 2). ²² chelator bifunctional זמין מסחרי חסונה זה ובאמינות יוצרת קשרים עם lysines של יציבים, thiourea קוולנטיים נוגדן (איור 3).

במהלך השנים האחרונות, במגוון רחב של ⁸⁹ radioimmunoconjugates כותרת ZR-DFO דווח בספרות. חקירות פרה-קליניים היו שופעות במיוחד, הכוללות נוגדנים הנעים בין ידוע יותר cetuximab, bevacizumab, וtrastuzumab לנוגדנים אזוטריים יותר כמו T מיקוד CD105RC105 וfPSA מיקוד 5A10. ^30-36 לאחרונה, מספר קטן של ניסויים קליניים בשלבים המוקדמים באמצעות ⁸⁹ נוגדנים שכותרתו ZR-DFO צמחו בספרות. ניסויים באופן ספציפי, קבוצות בהולנד פרסמו העסקת ⁸⁹ U36 ZR-DFO-cmAb, ⁸⁹ tiuxetan ZR-DFO-ibritumomab, ו ^-89 ZR-DFO-trastuzumab. ^21,32,37 בנוסף, מגוון רחב של ניסויים קליניים אחרים עם ⁸⁹ radioimmunoconjugates כותרת ZR כרגע בעיצומו, ובכלל זה חקירות כאן בMemorial Sloan Kettering Cancer Center באמצעות ⁸⁹ ZR-DFO-J591 PSMA מיקוד הדמיה סרטן הערמונית ^וZR-89 DFO-trastuzumab מיקוד HER2 הדמיה סרטן השד. ^{23, 30} בנוסף, בעוד נוגדני radiolabeled יישארו ⁸⁹ הרדיואקטיביות Zr כותרת הנפוצה ביותר, radiometal גם יותר ויותר הועסק עם וקטורים אחרים, כוללים פפטידים, חלבונים, וננו. ^38-43 </sup>

המודולריות של המתודולוגיה תיוג ZR-DFO זה ⁸⁹ היא נכס אדיר. הרפרטואר של נוגדני מיקוד סמן ביולוגי הוא המתרחב, והעניין בביצוע בתחום ההדמיה PET vivo באמצעות המבנים הללו צומח במהירות. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי הפיתוח של יותר שיטות ופרוטוקולים סטנדרטיים יכול להועיל השדה. פרוטוקול ניסוי נכתב מצוין לנטיית DFO-NCS וradiolabeling ⁸⁹ Zr כבר פורסם על ידי Vosjan, et al. ²² אנו חשים כי ההפגנה החזותית הניתנת על ידי עבודה זו יכולה לעזור לחוקרים חדשים לטכניקות אלה. בפרוטוקול ביד, J591 נוגדן אנטיגן קרום המיקוד ספציפי לערמונית ישמש כמערכת מודל להמחשה (1) bioconjugation של chelator bifunctional DFO-isothiocyanate לנוגדן, (2) radiosynthesis והטיהור של ⁸⁹ radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב,ו- (3) in vivo ההדמיה PET עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב ⁸⁹ במודל עכברי של הסרטן. ^23,44,45

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים in vivo תיארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ולפי ההנחיות האתיות של Memorial Sloan Kettering Cancer Center המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC). 1. הצמידה של DFO-NCS לJ591 בצינור mic…

Representative Results

הצעד הראשון בפרוטוקול זה נטיה של DFO-NCS לנוגדן הוא בדרך כלל די חזק ואמין. באופן כללי, ניתן לקבל immunoconjugate המטוהר,-שונה chelator בתשואה> 90%, ובאמצעות 3 שווה טוחנת של DFO-NCS בתגובת נטיה הראשונית תניב דרגה של תיוג של chelator של כ 1.0-1.5 DFO / מב. 89 Zr צעדי radiolabeling וטיהור של ההליך הם גם פש…

Discussion

בעוד בניית radioimmunoconjugates, הנקרא-ZR-DFO radiolabeling, וההדמיה של ⁸⁹ הוא בדרך כלל הליך ולא פשוט, זה חשוב לשמור על כמה שיקולים מרכזיים במוח במהלך כל שלב של התהליך. לדוגמא, אולי הסיבה הסבירה ביותר לדאגה במהלך שלב נטיה של ההליך היא הצבירה של הנוגדן בתגובה הצמידה. בעיה זו היא לרוב ?…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide