Den Bioconjugation og Radiosynthesis af⁸⁹ Zr-DFO-mærkede antistoffer

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

Den ekstraordinære affinitet, specificitet og selektivitet af antistoffer gør dem særdeles attraktive vektorer for tumor målrettet PET radioaktive lægemidler. På grund af deres multi-dages biologisk halveringstid, skal antistoffer være mærket med positron-emitterende radionuklider med relativt lange fysiske forfald halveringstider. Traditionelt positron-emitterende isotoper ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 timer), og ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 timer) er blevet anvendt til at mærke antistoffer til PET-billeddannelse. For nylig har imidlertid feltet oplevet en dramatisk stigning i brugen af positron-emitterende radiometal ⁸⁹ Zr i antistofbaserede PET imagografimidler. ⁸⁹ Zr er en næsten ideel radioisotop for PET imaging med immunokonjugater, som det har en fysisk halvdel -liv (t _1/2 = 78,4 timer), som er kompatibel med de in vivo farmakokinetik af antistoffer og udsender en relativ lav eneRGY positron, der producerer billeder i høj opløsning. Endvidere kan antistoffer ligefrem mærket med ⁸⁹ Zr hjælp af siderofor-afledte chelator desferrioxamin (DFO). I denne protokol, vil prostata-specifikke målretning membran-antigen-antistof J591 anvendes som et modelsystem til at illustrere (1) bioconjugation af den bifunktionelle chelator DFO-isothiocyanat til et antistof, (2) radiosynthesis og oprensning af en ⁸⁹ Zr- DFO-mAb radioimmunokonjugatet, og (3) in vivo PET billeddannelse med en ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunokonjugatet i en musemodel af cancer.

Introduction

På grund af deres bemærkelsesværdige følsomhed, affinitet og selektivitet er antistoffer længe været betragtet som lovende vektorer til levering af radioisotoper til cancerceller. Imidlertid har deres anvendelse i positronemissionstomografi (PET) billeddannelse været hæmmet af manglen på en passende positron-emitterende radioisotop for deres mærkning. ^1-3 En af de mest kritiske overvejelser i udformningen af radioimmunoconjugates matcher den fysiske forfald halv- levetid radioisotop til in vivo-farmakokinetik af antistoffet. Mere specifikt antistoffer har ofte forholdsvis lange, multi-dages biologiske halveringstider, og derfor skal mærkes med radioisotoper med sammenlignelige fysiske halveringstider. For PET billedbehandlingsprogrammer har antistoffer traditionelt været radioaktivt mærket med ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 timer), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 timer), eller ¹²⁴ I (t _1/2 = 4.18 d). ^4, Men hver af ⁵disse radioisotoper besidder væsentlige begrænsninger, der hæmmer deres egnethed til klinisk billeddannelse. Mens radioimmunoconjugates mærket med ⁸⁶ Y og ⁶⁴ Cu har vist lovende i prækliniske undersøgelser, begge isotoper besidder fysiske halveringstider, der er for kort til at være effektiv til billeddannelse i mennesker. ¹²⁴ Jeg derimod har en næsten ideel fysisk halveringstid for billeddannelse med antistoffer, men det er dyrt og har suboptimale henfald egenskaber, der fører til relativt lav opløsning kliniske billeder. Endvidere kan ^124-mærket radioimmunoconjugates underkastes dehalogenering in vivo, en proces, der kan sænke tumor-til-baggrund aktivitet forhold. ^6,7

Drevet til at finde en positron-emitterende radioisotop at fortrænge ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y, og ¹²⁴ jeg i radioimmunoconjugates har givet næring den seneste stigning i forskning i ⁸⁹ Zr-mærkede antistoffer. ^8-12 Than årsag til fremkomsten af ⁸⁹ Zr er ligetil: de radiometal besidder næsten ideelle kemiske og fysiske egenskaber til brug i diagnostiske PET radioimmunoconjugates ^{13 89} Zr fremstilles via ⁸⁹ Y (p, n) ⁸⁹ Zr reaktion på en cyklotron ved hjælp af en. kommercielt tilgængelige og 100% naturligt forekommende ⁸⁹ Y målet. ^14,15 Den radiometal har en positron udbytte på 23%, henfalder med en halveringstid på 78,4 timer og udsender positroner med den relativt lave energi 395,5 keV (figur 1). ^13,16,17 Det er vigtigt at bemærke, at ⁸⁹ Zr udsender også en høj energi, 909 keV γ-ray med 99% effektivitet. Mens dette emission ikke griber energisk med de udsendte 511 keV fotoner, det kræver ekstra overvejelser med hensyn til transport, håndtering og dosimetri. Trods denne advarsel disse henfaldskarakteristikkerne sidste ende betyder, at ⁸⁹ Zr ikke kun har en gunstigere half-liv for billeddannelse med antistoffer end ⁸⁶ Y og ⁶⁴ Cu men kan også producere billeder med højere opløsning end ¹²⁴ I, som udsender positroner med højere energier 687 og 975 keV, samt et antal fotoner med energier inden 100-150 keV af 511 keV positron-skabte fotoner. ¹³ Endvidere ⁸⁹ Zr er også sikrere at håndtere, billigere at fremstille, og residualizes i tumorer mere effektivt end dets radioaktivt modstykke. ^18,19 En mulig begrænsning af ⁸⁹ Zr er, at det ikke har en terapeutisk isotopologue fx ⁸⁶ Y (PET) vs. ⁹⁰ Y (terapi). Dette udelukker opførelsen af ​​kemisk identiske, surrogat billeddannende midler, der kan anvendes som dosimetriske spejdere til deres terapeutiske kolleger. Når det er sagt, undersøgelser tyder på, at ⁸⁹ Zr-mærkede antistoffer har potentiale som billeddannende surrogater for ⁹⁰ Y- og ¹⁷⁷ Lu-mærkede immunkonjugater.^20,21

Fra et kemisk synspunkt, som et gruppe IV metal, ⁸⁹ Zr eksisterer som en 4 kation i vandig opløsning. ZR ⁴⁺ ion er stærkt opladet, relativt stor (effektiv ionradius = 0,84 Å), og kan klassificeres som en "hård" kation. Som sådan er det udviser en præference for ligander, der bærer op til otte hårde, anioniske ilt donorer. Let den mest almindelige chelatoren anvendt i ⁸⁹ Zr-mærkede radioimmunoconjugates er desferrioxamin (DFO), en siderofor-afledt, acyklisk chelator bærer tre hydroxamat grupper. Liganden stabilt koordinerer Zr ⁴⁺ kation hurtigt og rent ved stuetemperatur på biologisk relevante pH-niveauer, og den resulterende Zr-DFO-kompleks forbliver stabil i løbet af flere dage i saltvand, blodserum og fuldblod. ²² Computational studier tyder stærkt at DFO danner et hexacoordinate kompleks med Zr ^4+, hvori metallet center er koordineret til tre Neutral og tre anioniske ilt donorer af liganden samt to eksogene vand ligander (Figur 2). ^23,24 In vivo opførsel radioimmunoconjugates beskæftiger den ⁸⁹ Zr-DFO konjugering stillads har generelt været fremragende. Men i nogle tilfælde, billedbehandling og akutte biodistributionsstudier har vist forhøjede aktivitetsniveauer i knoglerne i mus injiceret med ⁸⁹ Zr-mærkede antistoffer, data, der tyder på, at osteophilic ⁸⁹ Zr ⁴⁺ kation frigives fra chelatoren in vivo og efterfølgende mineralizes i knoglen. ^25. For nylig har en række undersøgelser af udviklingen af nye ⁸⁹ Zr ⁴⁺ chelatorer især ligander med otte ilt donorer har optrådt i litteraturen. ^24,26,27 dog på nuværende tidspunkt, DFO er den mest anvendte chelator i ⁸⁹ Zr-mærket radioimmunoconjugates med en bred margin. En række forskelligebioconjugation strategier er blevet anvendt til at fastgøre DFO til antistoffer, herunder bioorthogonal klik kemi, omsætning af thiol-reaktivt DFO konstruktioner med cysteiner i antistoffet, og omsætningen af aktiveret ester-bærende DFO konstruktioner med lysiner i antistoffet. ^{4,28- 30} Let den mest almindelige strategi har imidlertid været anvendelsen af et isothiocyanat-bærende derivat af DFO, DFO-NCS (figur 2). ²² Denne kommercielt tilgængelig bifunktionel chelator robust og pålideligt danner stabile, covalent thiourinstof-bindinger med lysinerne i antistof (figur 3).

I de seneste år har en lang række ⁸⁹ Zr-DFO-mærkede radioimmunoconjugates blevet rapporteret i litteraturen. Prækliniske undersøgelser har især været rigelige, og byder antistoffer lige fra de mere velkendte cetuximab, bevacizumab og trastuzumab til mere esoteriske antistoffer såsom CD105-targeting TRC105 og fPSA-targeting 5A10. ^30-36 Senere har et lille antal tidlige fase kliniske forsøg med ⁸⁹ Zr-DFO-mærkede antistoffer opstod i litteraturen. Konkret har grupper i Nederlandene publicerede forsøg beskæftiger ⁸⁹ Zr-DFO-cmAb u36, ⁸⁹ Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, og ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab. ^21,32,37 Derudover er en række andre kliniske forsøg med ⁸⁹ ZR-mærkede radioimmunoconjugates er igangværende, herunder efterforskning her på Memorial Sloan Kettering Cancer Center ved hjælp af PSMA-målretning ⁸⁹ Zr-DFO-J591 for prostatakræft billedbehandling og HER2-rettet ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab for brystkræft billeddannelse. ^{23, 30} Hertil kommer, mens radiomærkede antistoffer forbliver de mest almindelige ⁸⁹ Zr-mærkede radioaktive lægemidler den radiometal er også i stigende grad været ansat andre vektorer, herunder peptider, proteiner og nanomaterialer. ^38-43 </sup>

Den modularitet med denne ⁸⁹ Zr-DFO mærkning metode er et enormt aktiv. Repertoiret af biomarkør målretning antistoffer er stadigt voksende, og interessen for at udføre in vivo PET-billeddannelse ved hjælp af disse konstruktioner er i hastig vækst. Som et resultat mener vi, at udviklingen af ​​mere standardiserede fremgangsmåder og protokoller kan gavne området. En fremragende skrevet forsøgsprotokol til DFO-NCS konjugering og ⁸⁹ Zr radioaktiv mærkning er allerede blevet offentliggjort af Vosjan, et al. ²² Vi føler, at det visuelle demonstration, som dette arbejde yderligere kunne hjælpe efterforskerne ny på disse teknikker. I protokollen ved hånden, vil prostata-specifikke målretning membran-antigen-antistof J591 anvendes som et modelsystem til at illustrere (1) bioconjugation af den bifunktionelle chelator DFO-isothiocyanat til et antistof, (2) radiosynthesis og oprensning af ⁸⁹ ZR-DFO-mAb radioimmunokonjugatet,og (3) in vivo PET billeddannelse med en ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunokonjugatet i en musemodel af cancer. ^23,44,45

Protocol

Alle de in vivo dyreforsøg beskrevne blev udført efter en godkendt protokol og under de etiske retningslinjer for Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). 1. Konjugering af DFO-NCS til J591 I et 1,7 ml mikrocentrifugerør, fremstilles en opløsning 2-5 mg / ml J591 i 1 ml af enten 1x phosphatpufret saltvand (pH 7,4) eller 0,5 M HEPES-buffer (pH 7,4). Opløs DFO-NCS i tørt DMSO ved en koncentration på mellem 5-1…

Representative Results

Det første skridt i denne protokol bøjningen af ​​DFO-NCS til antistoffet er typisk ganske robust og pålidelig. Generelt kan det oprensede, chelator-modificerede immunokonjugat opnås i> 90% udbytte, og under anvendelse af 3 molækvivalenter af DFO-NCS i den oprindelige konjugationsreaktion vil give en vis-of-mærkning af chelatoren omtrent 1,0-1,5 DFO / mAb. De 89 Zr radioaktiv mærkning og purifikationstrin proceduren er også ligetil. Ved de koncentrationer, der er skitseret i ovennævnte protoko…

Discussion

Mens byggeriet, radioaktiv mærkning, og billedbehandling på ⁸⁹ Zr-DFO-labled radioimmunoconjugates er generelt en temmelig enkel procedure, er det vigtigt at holde et par vigtige overvejelser i tankerne i hvert trin i processen. For eksempel, måske den mest sandsynlige årsag til bekymring under konjugering trin i proceduren er sammenlægning af antistoffet under konjugationsreaktionen. Dette problem er mest ofte et produkt af dårlig blanding af konjugeringsreaktionen efter tilsætningen af DFO-NCS stamop…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide