와 전염성 해면상 뇌증 종 장벽 평가<em> 체외</em> 프리온 단백질 변환 분석
Summary
Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.
Abstract
Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host’s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host’s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.
Introduction
전염성 해면상 뇌증 (TSEs, 프리온 질환) 동물과 인간의 다양한 영향을 확장 배양 기간이 치명적인 신경 퇴행성 질환의 그룹입니다. TSEs의 추정 병인 제는 감염, 질병 – 관련에 PRP PRP (C)의 정상 세포 형태의 템플릿 기반의 변환에 의해 자기 전파 할 수있는 호스트 프리온 단백질 (PRP)의 미스 폴딩 이성체로 구성되는 감염된 호스트 1의 중추 신경계 조직에 축적 형태 PRP (TSE). 전염성 프리온은 일반적으로 포유 동물 종간 송신이 제한 이벤트 「TSE 종 장벽 "이라는 개념이 탄생했다 종 특이 방식으로, 호스트 간에서 송신한다. 프리온 종 장벽의 생물학적 결정은 잘 이해되지 않습니다. 감염성 PRP TSE 호스트 PRP C C 사이의 아미노산 서열 유사성강력 변환 3-5 일어난다하지만, 생체 내 6,7에서 관찰 된 모든 프리온 전송 이벤트를 설명하기에 불충분 남아 있는지에 영향을 미친다.
따라서, TSE 종 장벽 특성은 주로 동물 도전 연구에 의존했다 : 서로 프리온에 주어진 종으로부터 나이브 동물을 노출시키고 질병 발병과 전송 효율의 지표로서 공격 속도로 얻어진 배양 시간을 측정. 이종 종에서 PRP C를 발현하는 마우스는 연구 8 이런 종류의에 사용됩니다. 트랜스 제닉 마우스의 제작 및 프리온 장기화 생물 검정뿐만 아니라 동물의 윤리적 사용과 관련된 비용은 TSE 종 장벽 실험 조사 장애물이다. TSEs에 대한 인간 종 장벽의 평가는 인간의 PRP C를 발현하도록 유전자 조작 된 생쥐에 의존한다. 이 마우스는 인간의 TSEs 또는이 t 수정에 굴복 긴 배양 기간을 필요로빠른 질병 발병 9 그가 인간의 PRP C 분자. 이 마우스에서 인간이 아닌 TSEs에 대한 배양 기간은 도전 부정적인 결과의 해석을 정상 마우스의 수명을 넘어 연장 할 수있다. 비 – 인간 영장류는 인간 종 장벽을 연구하기위한 프록시로서 사용되었지만, 그것은 인간 숙주에 진행됨에 따라 이러한 연구 정확하게 질병 요점을 되풀이되지 않을 동물 실험과 인간이 아닌 영장류의 다른 유형과 같은 문제점을 내포한다.
동물 생물 검정은 TSE에 종의 감수성을 측정하기위한 "금 표준"방법 남아 있지만, 장애물, 비용이 살아있는 동물 실험의 윤리 대안의 조사를 강요했다. PRP TSE에 의해 시드 단백질 분해 효소 K (PK)에 내성 상태 PRP (입술)에 호스트 PRP C의 변환을 평가에 따라 체외 분석,의 숫자는 개발 TSE 특검팀을 조사하기 위해 사용되어왔다ecies 장벽 10-12. 시험 관내 분석법의 예로는 무 세포 분석법 변환, 증폭 단백질 환상 (PMCA)를 미스 폴딩 및 변환 효율을 율 (CER) 10-14 분석을 포함한다. 이러한 분석 중 어느 것도 자연 감염 후 종 장벽에 관련된 계정 주변 요인을 고려하지 않지만, 모든 TSEs 잠재적으로 취약 호스트를 식별하는 데 유용 할 수 있습니다.
여기에서는 정상 뇌 균질 액으로부터 유도 두 변성 PRP C 기판이 벤치 탑 프리온 전환 반응에 사용되는 CER 분석 용 프로토콜, (도 1) (13)을 제시한다. pH를 7.4로 변성 기판 PRP C 만 종 장벽 (14)의 부재 하에서, 반응에 의해 시드 PRP TSE PRP 해상도로 전환시킬 수있다. 대조적으로, pH가 3.5에서 다른 기판에 PRP C 변성은 PRP 입술 다음 배양으로 변환 될 수 있도록어떤 종에서 PRP TSE로 변환을위한 제어 역할을합니다. pH가 3.5 기판의 pH가 7.4에 대해 기판의 PRP 입술에 PRP C의 변환의 비율은 종 장벽의 측정치를 제공한다. 우리는 CER 분석 다양한 TSEs에 실험실 쥐의 종 장벽 알려져을 예측 및 만성 소모성 질환 (CWD) 및 기타 TSEs 14 뿔양 등 다양한 포유 동물 종의 종 장벽을 예측하기위한 노력의 분석을 사용한 것을 발견했다 15. 유용이 방법을 찾을 수 TSE 종 장벽 또는 PRP C -to-PRP 해상도 변환의 평가를 신속하게 검사를 허용하는 도구에 관심 수사관.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 성공적인 완료를 들어, 관심 기판 제조 (단계 2.1.2) 및 전환 반응 (단계 4.4.2)에 대한 비율을 기판에 시드에 사용되는 감염되지 않은 뇌 조직에서 PRP C 수준으로 지불해야합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 뇌는 한 PRP C는 면역 (그림 4)에 의해 존재로, 상당한 기간 부검 후 CER 기판으로 사용하기 위해 추출 할 수 있습니다. 실제로 일부는 자기 분해 CER 연?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O’Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4X | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10X | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemica; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
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