الشيتوزان / التدخل RNA الجسيمات النانوية وساطة جين إسكات في الأمراض ناقل يرقات البعوض
Summary
نحن هنا وصف الإجراء لتثبيط وظيفة الجينات في البعوض ناقلات الأمراض من خلال استخدام الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي يتم تناولها من قبل يرقات.
Abstract
البعوض الحامل للمرض إلحاق المزيد من المعاناة البشرية من أي كائن حي آخر – وتقتل أكثر من مليون شخص كل عام. مشاريع الجينوم البعوض سهلت البحث في جوانب جديدة من البعوض البيولوجيا، بما في ذلك الدراسات الجينية وظيفية في الابتدائي متجه الأفارقة الملاريا الأنوفيلة الغامبية وحمى الضنك والحمى الصفراء ناقلات الزاعجة المصرية. وقد استخدم RNA interference- (RNAi-) بوساطة إسكات الجينات لاستهداف الجينات في المصالح في كل من هذه الأنواع من البعوض ناقلات الأمراض. هنا، نحن تصف الإجراء لإعداد الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي يتم جنبا إلى جنب مع المواد الغذائية وتناولها من قبل يرقات. هذا واضحة من الناحية الفنية، الإنتاجية العالية، ومنهجية غير مكلفة نسبيا، والذي يتوافق مع طويلة RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) أو التدخل RNA (سيرنا) جزيئات صغيرة، وقد استخدمت لضربة قاضية ناجحة لعدد من الجينات المختلفة في A. الغامبية وA. الزاعجة المصريةاليرقات. وبعد الوجبات اليرقات، ضربة قاضية، والتي يتم التحقق منها من خلال QRT-PCR أو التهجين في الموقع، يمكن أن تستمر على الأقل خلال مرحلة العذراء في وقت متأخر. قد تكون هذه المنهجية تنطبق على مجموعة متنوعة واسعة من البعوض والحشرات الأخرى، بما في ذلك الآفات الزراعية، وكذلك الكائنات غير نموذج الأخرى. وبالإضافة إلى فائدتها في مختبر أبحاث، في المستقبل، الشيتوزان، وهو بوليمر غير مكلفة، وغير سامة وقابلة للتحلل، يحتمل أن تستخدم في هذا المجال.
Introduction
البعوض التغذية ناقلات دماء أنوفيلي وAedine أجناس تنقل العوامل المسببة للمرض مسؤولة عن العديد من أسوأ الآفات البشرية. ما يقدر بنحو 3.4 مليار شخص معرضون لخطر الإصابة بالملاريا ل، وهو المسؤول عن أكثر من نصف مليون حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. النتائج الملاريا من العدوى عن طريق المتصورة ليرة سورية. الطفيليات، والتي تنتقل إلى البشر من خلال لدغات البعوض الحامل للجنس الأنوفيليس، بما في ذلك ناقلات الأفارقة الرئيسي الأنوفيلة الغامبية ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ ، 2014) 1. الزاعجة المصرية هي البعوض الناقل الرئيسي لفيروس حمى الضنك، والذي يسبب حمى الضنك، وهو مرض حموي غير محدد وهذا هو المرض الأكثر انتشارا والفيروسة المنقولة بالمفصليات كبير في العالم. فيروس حمى الضنك في الوقت الحاضر تهديدا لل> 2.5 مليار شخص في المناطق المدارية، مع inciden سنويم ما يقرب من 50 مليون الحالات مما أدى إلى ~ 24،000 حالة وفاة سنويا ( http://www.cdc.gov/dengue/ ، 2014) 2. وعلى الرغم من تأثير عالمي مدمر من الأمراض التي تنتقل عن طريق البعوض على صحة الإنسان، وسيلة فعالة لمنع وعلاج هذه الأمراض تنعدم. مكافحة البعوض هي حاليا أفضل طريقة للوقاية من الأمراض.
وقد تم الاعتراف الإمكانات لمكافحة الأمراض المنقولة المفصلية التي كتبها التلاعب الجيني للالحشرات ناقلات لأكثر من أربعة عقود 3. سلالات معدلة وراثيا من A. بعوض هندستها لديك امرأة معينة كظوم يطير النمط الظاهري جعلت مؤخرا إمكانية استخدام استراتيجيات المعدلة وراثيا لمكافحة ناقلات الأمراض واقعا 4-6. وقد تحدت هذه التطورات الباحثين من تحديد الأهداف وراثية جديدة لمكافحة النواقل وسائل إضافية من التلاعب وظيفة الجين في البعوض الناقل للمرض. تحوير التعبير الجيني دتنمية خلال شهر، كما كان الحال في البعوض الأنثى يطير 4، قد تعزز توضيح استراتيجيات جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض. ومع ذلك، إلى حد كبير بسبب التحديات التقنية، تم التعرف على وظائف عدد قليل جدا من الجينات خلال تطوير A. الغامبية، A. بعوض، أو الأنواع الأخرى من البعوض.
منذ اكتشافه في C. ايليجانس 7، والتدخل RNA (رني)، والتي يتم حفظها في الحيوانات والنباتات، والكائنات الدقيقة، وقد استخدمت على نطاق واسع للدراسات وراثية وظيفية في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية، بما في ذلك الحشرات 8،9. يبدأ مسار رني التي كتبها المقامر الذي يشق طويلة الرنا المزدوج الجديلة في 20-25 الرناوات siRNAs طويلة النوكليوتيدات القصيرة التي تعمل بوصفها تسلسل محدد التدخل RNA. الجينات الصمت الرناوات siRNAs التي هي مكملة في تسلسل من خلال تعزيز دوران النص، انشقاق، وتعطيل الترجمة 9. جزيئات الرنا المزدوج الجديلة طويلة (عادة 300-600 بي بي) أو العرف الرناوات siRNAs استهداف particulaتسلسل ص يمكن استخدامها في مختبر أبحاث لإسكات أي الجينات في المصالح. من خلال إدارة التدخل عندما يتم تسليم RNA، يمكن للباحثين التحكم في الوقت الذي الجينات إسكات يبادر. هذه الميزة مفيدة لأنها يمكن أن تستخدم للتغلب على التحديات مثل الفتك التنموية أو العقم، والتي يمكن أن تعوق إنتاج وصيانة سلالات تحمل طفرات وراثية، وهي عملية مكلفة وكثيفة العمالة التي لا تتوفر في جميع أنواع الحشرات بعد. على الرغم من أن درجة إسكات الجينات التي كتبها رني يمكن أن تختلف من الجينات إلى الجينات، الأنسجة إلى الأنسجة، والحيوان الى الحيوان، ويستخدم على نطاق واسع رني للتحليل وظيفي من الجينات في البعوض والحشرات الأخرى 8،9.
وقد استخدمت ثلاث استراتيجيات التدخل تسليم RNA في البعوض: حقن مكروي، تمرغ / التطبيق الموضعي، والابتلاع. للتعرف على تاريخ مفصل والمقارنة من استخدام هذه التقنيات الثلاث في الحشرات، يرجى الرجوع إلى يو وآخرون 8. Wه وقد استخدمت بنجاح حقن مكروي 10 كوسيلة لتقديم الرناوات siRNAs لاستهداف الجينات التنموية في A. الأجنة بعوض، يرقات، عذارى و11-14. ومع ذلك، تتطلب هذه الاستراتيجية تسليم كثيفة العمالة على حد سواء الإعداد حقن مكروي ويد ماهرة. وعلاوة على ذلك، هو حقن مكروي مرهقة للكائن الحي، وهو عامل التباس، وخاصة عندما سيتم تقييم الظواهر السلوكية. وأخيرا، لا يمكن تمديد تسليم حقن مكروي إلى الميدان لمكافحة النواقل. وكبديل لذلك، تمرغ الكائن في التدخل الحل RNA كما أصبحت وسيلة شعبية للحمل إسكات الجينات، كما أنها مريحة ويتطلب معدات قليلة أو العمل. وقد تم تطبيقها في المقام الأول تمرغ في خط الخلية الحشرات يدرس 8، ولكن في دراسة حديثة، وقد تحقق ضربة قاضية في A. بعوض اليرقات مغمورة في محلول من الرنا المزدوج الجديلة 15، والتي ظهرت الحيوانات أن تناول. ومع ذلك، من أجل دراسة شملت تحليل experimenta متعددةمجموعات لتر أو الظواهر، تمرغ مكلف نوعا ما. لوبيز مارتينيز وآخرون. 16 وصفت الإماهة مدفوعة رني، نهجا جديدا للتدخل تسليم RNA الذي ينطوي على الجفاف في محلول ملحي والإماهة مع قطرة واحدة من المياه التي تحتوي على التدخل RNA. لا تقطع هذا النهج التكاليف المرتبطة الغمر الحيوان كله، ولكن هي أكثر تكلفة من حقن مكروي وربما تكون محدودة في تطبيقه على الأنواع التي يمكن أن يتسامح مع الضغوط الأسموزية العالية. وعلاوة على ذلك، فمن الصعب أن نتصور كيف يمكن تكييفها الغمر أو منهجية الغمر / الإماهة الجفاف لمكافحة ناقلات الأمراض في هذا المجال. لهذه الأسباب، لدراسات ما بعد الجنينية، والتسليم بالتدخل RNA مع الطعام تناولها هو استراتيجية بديلة قابلة للحياة.
على الرغم من أن الاستراتيجيات القائمة على ابتلاع لا تعمل في جميع أنواع الحشرات، وربما أبرزها ذبابة الفاكهة البطن، وقد شجعت تسليم عن طريق الفم بالتدخل RNA مختلطة مع الطعام سي جينlencing في مجموعة متنوعة من الحشرات 8،17، بما في ذلك A. بعوض البالغين 18. وصفنا الشيتوزان بوساطة جسيمات متناهية الصغر رني في A. الغامبية يرقات 19 وطبقت بنجاح هذا النهج للحد من التعبير الجيني في A. بعوض اليرقات 20،21. هنا، ومنهجية لهذا الإجراء رني، الذي ينطوي على entrapping بالتدخل RNA من قبل الشيتوزان البوليمر، هو مفصل. تتشكل الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي كتبها التجميع الذاتي للpolycations مع التدخل RNA من خلال القوى الكهروستاتيكية بين الشحنات الموجبة من المجموعات الأمينية في الشيتوزان والشحنات السالبة التي تحملها مجموعات الفوسفات على العمود الفقري بالتدخل RNA 19. الإجراء الموضح متوافق مع كل من جزيئات الرنا المزدوج الجديلة الطويلة (المشار إليها فيما يلي باسم الرنا المزدوج الجديلة) أو مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل سيرنا (المشار إليه فيما بعد سيرنا). يتم خلط التالية التوليف، الشيتوزان / التدخل النانوية RNA مع الطعام اليرقات وتسليمها إلىاليرقات من خلال الابتلاع عن طريق الفم. هذه المنهجية غير مكلفة نسبيا، ويتطلب القليل من المعدات والعمالة 19، وتسهل تحليل الإنتاجية العالية من الظواهر متعددة، بما في ذلك تحليل السلوكيات 20،21. من المحتمل أن هذه المنهجية، التي يمكن تكييفها للدراسات إسكات الجينات في الحشرات الأخرى، بما في ذلك ناقلات الأمراض الأخرى والآفات الزراعية الحشرات، يمكن استخدامها لإسكات الجينات في مجموعة متنوعة من الأنواع الحيوانية الأخرى. وعلاوة على ذلك، الشيتوزان، وهي غير مكلفة، وغير سامة وقابلة للتحلل البوليمر 22، من المحتمل أن تستخدم في الميدان لمكافحة البعوض أنواع محددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدم / التدخل منهجية جسيمات متناهية الصغر RNA الشيتوزان الموصوفة هنا لاستهداف الجينات بشكل فعال خلال نمو اليرقات في A. الغامبية (أرقام 2 و 3) وA. الزاعجة المصرية (أرقام 4، 5، 6، الجدولين 1 و 2). الشيتوزان النانوية يمكن أن تكون على استعداد مع إ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
References
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).
- Haugen, M., et al. . Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
