Summary

Chitosan / interfererende RNA Nanopartikel medieret gendæmpning i Disease Vector myggelarver

Published: March 25, 2015
doi:

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at inhibere gen-funktion i smittebærende myg ved anvendelse af chitosan / interfererende RNA nanopartikler, der indtages af larver.

Abstract

Vector myg påføre mere menneskelige lidelser end nogen anden organisme og dræbe mere end en million mennesker hvert år. Myg genomprojekter lettet forskning i nye facetter af myg biologi, herunder funktionelle genetiske undersøgelser i den primære afrikanske malaria vektor Malariamyg og dengue og gul feber vektor Aedes aegypti. RNA interferensfri (RNAi-) medieret gendæmpning er blevet anvendt til at målrette gener af interesse i begge disse smittebærende myg arter. Her beskriver vi en procedure for udarbejdelse af chitosan / interfererende RNA nanopartikler, der er kombineret med mad og indtages af larver. Denne teknisk ligetil, high-throughput, og relativt billig metode, som er kompatibel med langt dobbeltstrenget RNA (dsRNA) eller små interfererende RNA (siRNA) molekyler, er blevet anvendt til vellykket knockdown af et antal forskellige gener i A. gambiae og A. aegyptilarver. Efter larver fodringer, knockdown, som er verificeret gennem QRT-PCR eller in situ hybridisering, kan vare i det mindste ved den sene puppestadiet. Denne metode kan anvendes på en bred vifte af myg og andre insekter, herunder landbruget skadedyr, såvel som andre ikke-modelorganismer. Ud over sin anvendelighed i forskningslaboratoriet i fremtiden, chitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrydelig polymer, potentielt kunne anvendes i marken.

Introduction

Blood fodring vektor myg af Anopheline og Aedine slægter overføre smitstoffer, der er ansvarlige for flere af de værste svøber i menneskeheden. Det anslås 3,4 milliarder mennesker er i risiko for at få malaria, som er ansvarlig for mere end en halv million dødsfald om året på verdensplan. Malaria skyldes smitte med Plasmodium sp. Parasitter, som transmitteres til mennesker via stik fra inficerede myg i Anopheles slægten, herunder hovedstol afrikanske vektor Malariamyg ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ 2014) 1. Aedes aegypti er den primære mosquito vektor til dengue virus, der forårsager dengue feber, en uspecifik febril sygdom, som er den mest udbredte og betydelig arboviral sygdom i verden. Dengue virus er i øjeblikket en trussel mod> 2,5 milliarder mennesker i troperne, med en årlig incidence på ca. 50 millioner tilfælde resulterer i ~ 24.000 dødsfald om året ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. På trods af den ødelæggende globale virkninger af myg-bårne sygdomme på menneskers sundhed, er effektive midler til at forebygge og behandle disse sygdomme mangler. Mosquito kontrol er i øjeblikket den bedste metode sygdomsforebyggelse.

Potentialet til styring leddyr sygdomme ved genmanipulation af insekter er blevet anerkendt i mere end fire årtier 3. Transgene stammer af A. aegypti manipuleret til at have en repressible kvinde-specifik flyve fænotype har for nylig gjort mulighederne for at anvende transgene vektor kontrolstrategier en realitet 4-6. Disse fremskridt har udfordret forskere at identificere nye genetiske mål for vektor kontrol og supplerende middel til at manipulere genfunktion i vektor myg. Ændring af genekspression dnder udvikling, som det var tilfældet i kvindedominerede flyve myg 4, kan fremme opklaringen af nye vektor kontrolstrategier. Men hovedsagelig på grund af tekniske udfordringer, funktionerne af meget få gener er blevet karakteriseret under udviklingen af A. gambiae, A. aegypti eller andre myg arter.

Siden opdagelsen i C. elegans 7 RNA-interferens (RNAi), som er konserveret i dyr, planter og mikroorganismer, er blevet udbredt anvendt til funktionelle genetiske undersøgelser i en lang række organismer, herunder insekter 8,9. RNAi er initieret af Dicer, som spalter lang dsRNA i korte 20-25 nucleotid lange siRNA'er der fungerer som sekvensspecifik interfererende RNA. siRNA'er stilhed gener, som er komplementære i rækkefølge ved at fremme udskrift omsætning, spaltning, og afbrydelse af oversættelse 9. Lange dsRNA molekyler (typisk 300-600 bp) eller brugerdefinerede siRNA'er rettet mod en particular sekvens kan anvendes i forskningslaboratoriet til silencing helst gen af ​​interesse. Ved at styre når interfererende RNA leveres, kan forskerne styre det tidspunkt, hvor gendæmpning indviede. Denne fordel er nyttigt, da det kan bruges til at overvinde udfordringer såsom udviklingsmæssige letalitet eller sterilitet, som kan hæmme produktion og vedligeholdelse af stammer, der bærer arvelige mutationer, et dyrt og arbejdskrævende proces, som endnu ikke er tilgængelig i alle insektarter. Selvom graden af gendæmpning af RNAi kan variere fra gen gen, væv til væv og dyr til dyr, er RNAi vid udstrækning anvendes til funktionel analyse af gener i myg og andre insekter 8,9.

Tre interfererende RNA levering strategier er blevet anvendt i myg: mikroinjektion, iblødsætning / topisk anvendelse og indtagelse. For en detaljeret historie og sammenligning af anvendelsen af disse tre teknikker i insekter, henvises til Yu et al 8. We har med succes brugt mikroinjektion 10 som et middel til at levere siRNAs at målrette udviklingsmæssige gener i A. aegypti embryoner, larver og pupper 11-14. Men denne arbejdskrævende levering strategi kræver både en mikroinjektion setup og en dygtig hånd. Desuden mikroinjektion er stressende for organismen, forstyrrende element, især når adfærdsmæssige fænotyper vil blive vurderet. Endelig kan mikroinjektion levering ikke udvides til området for vektor kontrol. Som et alternativ har iblødsætning organismen i interfererende RNA løsning også blevet et populært middel til at fremkalde gendæmpning, som det er praktisk og kræver lidt udstyr eller arbejdskraft. Opblødning er primært blevet anvendt i insektcellelinie studerer 8, men i en nylig undersøgelse blev knockdown opnået i A. aegypti larver nedsænket i en opløsning af dsRNA 15, hvor dyrene syntes at være indtagelsen. For undersøgelser med analyse af flere Experimental grupper eller fænotyper, iblødsætning er temmelig dyrt. Lopez-Martinez et al. 16 beskrevne rehydrering drevet RNAi, en ny tilgang til interfererende RNA levering, der involverer dehydrering i saltopløsning og rehydratisering med en enkelt dråbe vand indeholdende interfererende RNA. Denne tilgang har skåret omkostningerne i forbindelse med hele dyr fordybelse, men er dyrere end mikroinjektion og kan begrænses i sin anvendelse på arter, der kan tåle høje osmotiske tryk. Desuden er det vanskeligt at forestille sig, hvordan nedsænkning eller dehydrering / rehydrering nedsænkning metode kan tilpasses til vektor kontrol i marken. Af disse grunde, til post-embryonale undersøgelser, levering af interfererende RNA med indtaget mad er et levedygtigt alternativ strategi.

Selvom Indtagelse-strategier ikke virker på alle insektarter, måske især Drosophila melanogaster, har oral indgivelse af interfererende RNA blandet med mad fremmes gen silencing i en række insekter 8,17, herunder A. aegypti voksne 18. Vi beskrev chitosan nanopartikel-medieret RNAi i A. gambiae larver 19 og har med succes anvendt denne metode til reduktion af genekspression i A. aegypti larver 20,21. Her metode for denne RNAi procedure, som indebærer indfange af interfererende RNA ved polymer chitosan, er detaljeret. Chitosan / interfererende RNA nanopartikler dannes ved selvsamling af polykationer med interfererende RNA gennem de elektrostatiske kræfter mellem positive ladninger af aminogrupperne i chitosan og negative ladninger båret af phosphatgrupper på rygraden af interfererende RNA 19. Den beskrevne fremgangsmåde er kompatibel med både lange dsRNA molekyler (herefter benævnt dsRNA) eller dobbeltstrenget siRNA (i det følgende benævnt siRNA). Efter syntese chitosan / interfererende RNA nanopartikler blandes med larvernes mad og leveret tillarver ved indtagelse. Denne metode er relativt billig, kræver lidt udstyr og arbejdskraft 19, og letter high-throughput analyse af flere fænotyper, herunder analyse af adfærd 20,21. Denne metode, som kan tilpasses til gendæmpning undersøgelser i andre insekter, herunder andre sygdomsvektorer og insekt skadedyr i landbruget, kan potentielt anvendes til gen-silencing i en lang række andre dyrearter. Desuden kunne chitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrydelig polymer 22 potentielt anvendes i feltet for artsspecifik myg.

Protocol

1. Mosquito Arter og avls- Vedligehold A. gambiae G3 og A. aegypti Liverpool IB12 stammer (som anvendes i de repræsentative undersøgelser nedenfor) eller andre stammer af renter i henhold til standard lab praksis eller som tidligere 23,24 beskrevet. 2. dsRNA og siRNA Design og Produktion Design primere til at konstruere lange dsRNA templates specifikke for genet af interesse. Bruge e-RNAi værktøj 25. Fremstil dsRNA iføl…

Representative Results

A. gambiae: Chitosan / dsRNA nanopartikler dannet på grund af den elektrostatiske vekselvirkning mellem aminogrupper af chitosan og phosphatgrupperne af dsRNA. Effektiviteten af ​​dsRNA inkorporering i nanopartikler er sædvanligvis over 90% som målt ved udtømning af dsRNA fra opløsningen. Atomic force mikroskopi billeder viser, at chitosan-dsRNA partikelstørrelse gennemsnit 140 nm i diameter, der spænder fra 100 til 200 nm (figur 1).</strong…

Discussion

Chitosan / interfererende RNA nanopartikel metode beskrevet heri er blevet anvendt effektivt til at målrette gener under larveudvikling i A. gambiae (figur 2, 3) og A. aegypti (figur 4, 5, 6, tabel 1, 2). Chitosan nanopartikler kan fremstilles med enten lang dsRNA eller siRNA, som begge er blevet anvendt med succes i myg som det fremgår af repræsentative resultater, der er beskrevet heri. Syntese af dsRNA er billigere end at købe siRNA, men er mere arbejdskrævende…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.

Materials

Name of Reagent/Equipment Company Catalog Number Comments/Descriptions
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100X15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

References

  1. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  2. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  3. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  4. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  6. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  7. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  8. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  9. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
  10. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
  11. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
  12. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  13. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
  14. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  15. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  16. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  17. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  18. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
  19. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
  20. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  21. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  22. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  23. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  24. Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).
  25. Haugen, M., et al. . Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).
  26. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  27. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  28. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  29. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  30. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  31. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  32. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  33. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  34. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  35. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
check_url/52523?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., Michel, K., Severson, D. W., Zhu, K. Y., Duman-Scheel, M. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523, doi:10.3791/52523 (2015).

View Video