Her beskriver vi en fremgangsmåde til at inhibere gen-funktion i smittebærende myg ved anvendelse af chitosan / interfererende RNA nanopartikler, der indtages af larver.
Vector myg påføre mere menneskelige lidelser end nogen anden organisme – og dræbe mere end en million mennesker hvert år. Myg genomprojekter lettet forskning i nye facetter af myg biologi, herunder funktionelle genetiske undersøgelser i den primære afrikanske malaria vektor Malariamyg og dengue og gul feber vektor Aedes aegypti. RNA interferensfri (RNAi-) medieret gendæmpning er blevet anvendt til at målrette gener af interesse i begge disse smittebærende myg arter. Her beskriver vi en procedure for udarbejdelse af chitosan / interfererende RNA nanopartikler, der er kombineret med mad og indtages af larver. Denne teknisk ligetil, high-throughput, og relativt billig metode, som er kompatibel med langt dobbeltstrenget RNA (dsRNA) eller små interfererende RNA (siRNA) molekyler, er blevet anvendt til vellykket knockdown af et antal forskellige gener i A. gambiae og A. aegyptilarver. Efter larver fodringer, knockdown, som er verificeret gennem QRT-PCR eller in situ hybridisering, kan vare i det mindste ved den sene puppestadiet. Denne metode kan anvendes på en bred vifte af myg og andre insekter, herunder landbruget skadedyr, såvel som andre ikke-modelorganismer. Ud over sin anvendelighed i forskningslaboratoriet i fremtiden, chitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrydelig polymer, potentielt kunne anvendes i marken.
Blood fodring vektor myg af Anopheline og Aedine slægter overføre smitstoffer, der er ansvarlige for flere af de værste svøber i menneskeheden. Det anslås 3,4 milliarder mennesker er i risiko for at få malaria, som er ansvarlig for mere end en halv million dødsfald om året på verdensplan. Malaria skyldes smitte med Plasmodium sp. Parasitter, som transmitteres til mennesker via stik fra inficerede myg i Anopheles slægten, herunder hovedstol afrikanske vektor Malariamyg ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ 2014) 1. Aedes aegypti er den primære mosquito vektor til dengue virus, der forårsager dengue feber, en uspecifik febril sygdom, som er den mest udbredte og betydelig arboviral sygdom i verden. Dengue virus er i øjeblikket en trussel mod> 2,5 milliarder mennesker i troperne, med en årlig incidence på ca. 50 millioner tilfælde resulterer i ~ 24.000 dødsfald om året ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. På trods af den ødelæggende globale virkninger af myg-bårne sygdomme på menneskers sundhed, er effektive midler til at forebygge og behandle disse sygdomme mangler. Mosquito kontrol er i øjeblikket den bedste metode sygdomsforebyggelse.
Potentialet til styring leddyr sygdomme ved genmanipulation af insekter er blevet anerkendt i mere end fire årtier 3. Transgene stammer af A. aegypti manipuleret til at have en repressible kvinde-specifik flyve fænotype har for nylig gjort mulighederne for at anvende transgene vektor kontrolstrategier en realitet 4-6. Disse fremskridt har udfordret forskere at identificere nye genetiske mål for vektor kontrol og supplerende middel til at manipulere genfunktion i vektor myg. Ændring af genekspression dnder udvikling, som det var tilfældet i kvindedominerede flyve myg 4, kan fremme opklaringen af nye vektor kontrolstrategier. Men hovedsagelig på grund af tekniske udfordringer, funktionerne af meget få gener er blevet karakteriseret under udviklingen af A. gambiae, A. aegypti eller andre myg arter.
Siden opdagelsen i C. elegans 7 RNA-interferens (RNAi), som er konserveret i dyr, planter og mikroorganismer, er blevet udbredt anvendt til funktionelle genetiske undersøgelser i en lang række organismer, herunder insekter 8,9. RNAi er initieret af Dicer, som spalter lang dsRNA i korte 20-25 nucleotid lange siRNA'er der fungerer som sekvensspecifik interfererende RNA. siRNA'er stilhed gener, som er komplementære i rækkefølge ved at fremme udskrift omsætning, spaltning, og afbrydelse af oversættelse 9. Lange dsRNA molekyler (typisk 300-600 bp) eller brugerdefinerede siRNA'er rettet mod en particular sekvens kan anvendes i forskningslaboratoriet til silencing helst gen af interesse. Ved at styre når interfererende RNA leveres, kan forskerne styre det tidspunkt, hvor gendæmpning indviede. Denne fordel er nyttigt, da det kan bruges til at overvinde udfordringer såsom udviklingsmæssige letalitet eller sterilitet, som kan hæmme produktion og vedligeholdelse af stammer, der bærer arvelige mutationer, et dyrt og arbejdskrævende proces, som endnu ikke er tilgængelig i alle insektarter. Selvom graden af gendæmpning af RNAi kan variere fra gen gen, væv til væv og dyr til dyr, er RNAi vid udstrækning anvendes til funktionel analyse af gener i myg og andre insekter 8,9.
Tre interfererende RNA levering strategier er blevet anvendt i myg: mikroinjektion, iblødsætning / topisk anvendelse og indtagelse. For en detaljeret historie og sammenligning af anvendelsen af disse tre teknikker i insekter, henvises til Yu et al 8. We har med succes brugt mikroinjektion 10 som et middel til at levere siRNAs at målrette udviklingsmæssige gener i A. aegypti embryoner, larver og pupper 11-14. Men denne arbejdskrævende levering strategi kræver både en mikroinjektion setup og en dygtig hånd. Desuden mikroinjektion er stressende for organismen, forstyrrende element, især når adfærdsmæssige fænotyper vil blive vurderet. Endelig kan mikroinjektion levering ikke udvides til området for vektor kontrol. Som et alternativ har iblødsætning organismen i interfererende RNA løsning også blevet et populært middel til at fremkalde gendæmpning, som det er praktisk og kræver lidt udstyr eller arbejdskraft. Opblødning er primært blevet anvendt i insektcellelinie studerer 8, men i en nylig undersøgelse blev knockdown opnået i A. aegypti larver nedsænket i en opløsning af dsRNA 15, hvor dyrene syntes at være indtagelsen. For undersøgelser med analyse af flere Experimental grupper eller fænotyper, iblødsætning er temmelig dyrt. Lopez-Martinez et al. 16 beskrevne rehydrering drevet RNAi, en ny tilgang til interfererende RNA levering, der involverer dehydrering i saltopløsning og rehydratisering med en enkelt dråbe vand indeholdende interfererende RNA. Denne tilgang har skåret omkostningerne i forbindelse med hele dyr fordybelse, men er dyrere end mikroinjektion og kan begrænses i sin anvendelse på arter, der kan tåle høje osmotiske tryk. Desuden er det vanskeligt at forestille sig, hvordan nedsænkning eller dehydrering / rehydrering nedsænkning metode kan tilpasses til vektor kontrol i marken. Af disse grunde, til post-embryonale undersøgelser, levering af interfererende RNA med indtaget mad er et levedygtigt alternativ strategi.
Selvom Indtagelse-strategier ikke virker på alle insektarter, måske især Drosophila melanogaster, har oral indgivelse af interfererende RNA blandet med mad fremmes gen silencing i en række insekter 8,17, herunder A. aegypti voksne 18. Vi beskrev chitosan nanopartikel-medieret RNAi i A. gambiae larver 19 og har med succes anvendt denne metode til reduktion af genekspression i A. aegypti larver 20,21. Her metode for denne RNAi procedure, som indebærer indfange af interfererende RNA ved polymer chitosan, er detaljeret. Chitosan / interfererende RNA nanopartikler dannes ved selvsamling af polykationer med interfererende RNA gennem de elektrostatiske kræfter mellem positive ladninger af aminogrupperne i chitosan og negative ladninger båret af phosphatgrupper på rygraden af interfererende RNA 19. Den beskrevne fremgangsmåde er kompatibel med både lange dsRNA molekyler (herefter benævnt dsRNA) eller dobbeltstrenget siRNA (i det følgende benævnt siRNA). Efter syntese chitosan / interfererende RNA nanopartikler blandes med larvernes mad og leveret tillarver ved indtagelse. Denne metode er relativt billig, kræver lidt udstyr og arbejdskraft 19, og letter high-throughput analyse af flere fænotyper, herunder analyse af adfærd 20,21. Denne metode, som kan tilpasses til gendæmpning undersøgelser i andre insekter, herunder andre sygdomsvektorer og insekt skadedyr i landbruget, kan potentielt anvendes til gen-silencing i en lang række andre dyrearter. Desuden kunne chitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrydelig polymer 22 potentielt anvendes i feltet for artsspecifik myg.
Chitosan / interfererende RNA nanopartikel metode beskrevet heri er blevet anvendt effektivt til at målrette gener under larveudvikling i A. gambiae (figur 2, 3) og A. aegypti (figur 4, 5, 6, tabel 1, 2). Chitosan nanopartikler kan fremstilles med enten lang dsRNA eller siRNA, som begge er blevet anvendt med succes i myg som det fremgår af repræsentative resultater, der er beskrevet heri. Syntese af dsRNA er billigere end at købe siRNA, men er mere arbejdskrævende…
The authors have nothing to disclose.
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |