A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.
छोटे अणुओं की वजह से मानव स्वास्थ्य और प्रदर्शन के विभिन्न पहलुओं की बायोमार्कर के रूप में उनके शारीरिक निहितार्थ को biosensing अनुप्रयोगों के लिए अमीर लक्ष्य प्रदान करते हैं। न्यूक्लिक एसिड aptamers तेजी biosensor प्लेटफार्मों पर मान्यता तत्व के रूप में लागू किया जाता है, लेकिन छोटे अणु लक्ष्य की ओर aptamers का चयन विशेष डिजाइन विचार की आवश्यकता है किया गया है। इस काम के संशोधन और छोटे अणु लक्ष्य के लिए संरचना-स्विचिंग aptamers चयन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है एक विधि का महत्वपूर्ण कदम का वर्णन है। चुंबकीय मोतियों पर पूरक डीएनए कब्जा जांच के लिए संकरित एक डीएनए पुस्तकालय से बंधन दृश्यों रचना में एक लक्ष्य प्रेरित परिवर्तन के माध्यम से nonbinders से अलग हो रहे हैं। समर्थन मैट्रिक्स (मोती) बाध्यकारी दृश्यों आगे परिलक्षित नहीं किया जाएगा क्योंकि यह विधि फायदेमंद है, और यह लक्ष्य अणु के स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, पिघलने कब्जा जांच के तापमान और पुस्तकालय, पर या थोड़ा आरटी से ऊपर रखा जाता है इस तरह के दृश्यों टी किऊष्मा के आधार पर टोपी dehybridize भी सतह पर तैरनेवाला समाधान में उपस्थित रहेंगे। यह प्रभावी रूप से (nonbinders दृश्यों से बाध्यकारी अलग लक्षित करने की क्षमता) विभाजन दक्षता की सीमा है, और इसलिए कई चयन राउंड पृष्ठभूमि दृश्यों को हटाने के लिए आवश्यक हो जाएगा। रिपोर्ट की विधि के कारण नकारात्मक चयन कदमों के कार्यान्वयन, सरलीकृत संवर्धन निगरानी, और बढ़ाया तंगी प्रदान करने के लिए चयन संवर्धन निम्नलिखित कब्जा जांच की लंबाई का विस्तार करने के लिए पिछले संरचना-स्विचिंग aptamer चयन से अलग है। चयनित संरचना-स्विचिंग aptamers aptamer के गठनात्मक परिवर्तन द्वारा एक लक्ष्य अणु की उपस्थिति की रिपोर्ट है कि एक सोने nanoparticle परख मंच में फायदेमंद हैं। यह एक नैदानिक या तैनात वातावरण में लाभकारी है कि एक सरल, तेजी से वर्णमिति readout के प्रदान करता है, क्योंकि सोने nanoparticle परख लागू किया गया था। डिजाइन और अनुकूलन विचार सबूत की सिद्धांत रूप में परख के लिए प्रस्तुत कर रहे हैंबफर में ई काम शारीरिक तरल पदार्थ में छोटे अणु biosensing की ओर काम के आगे विस्तार के लिए एक आधार प्रदान करने के लिए।
छोटे अणुओं लंबे समय से इस तरह के शारीरिक विषाक्तता या पोषण, सेल संकेतन, और रोग एक के रूप में दवा उपचार के रूप में विविध जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है के रूप में मान्यता दी गई है। विभिन्न छोटे अणुओं भी तनाव 2,3, थकान 4, और रोग 5 सहित शारीरिक स्थितियों का संकेत बायोमार्कर के रूप में सुझाव दिया गया है। उदाहरण के लिए, ऊंचा कोर्टिसोल के स्तर में कमी आई शारीरिक प्रदर्शन और अन्य स्वास्थ्य की स्थिति में 6-8 में हो सकता है, जो तनाव के साथ सहसंबंधी। इसी तरह, लार में कुछ पेप्टाइड्स के अनुपात में बदलाव शारीरिक अभिव्यक्तियाँ एकाग्रता की कमी, बिगड़ा प्रतिक्रिया समय, और कम संज्ञानात्मक समारोह 4 शामिल हैं, जहां थकान के भविष्य कहनेवाला हैं। इसलिए, छोटे अणुओं के स्तर की निगरानी करने के लिए लक्ष्य-विशिष्ट biosensors के विकास के एक व्यक्ति के स्वास्थ्य और प्रदर्शन क्षमताओं का आकलन करने के लिए एक अमूल्य मीट्रिक प्रदान कर सकता हैidual।
ऐतिहासिक, छोटे अणु का पता लगाने श्रम प्रधान जुदाई तकनीक के द्वारा या प्रतिरक्षी आधारित मान्यता 6,7 द्वारा प्रदर्शन किया गया है। हाल ही में, न्यूक्लिक एसिड aptamers 9,10 विशिष्ट अनुप्रयोगों में एंटीबॉडी से अधिक विशिष्ट लाभ के अधिकारी मान्यता है कि तत्व के रूप में उभरा है। 12 ऊतकों को धातु आयनों 11 से आकार में बदलती एक लक्ष्य बाध्य करने के लिए उनकी क्षमता के साथ, aptamers व्यापक रूप से biosensing प्लेटफार्मों 13,14 में मान्यता तत्व के रूप में लागू किया गया है। एंटीबॉडी की तुलना में, aptamers रासायनिक संश्लेषित है, और यह सतह स्थिरीकरण या रिपोर्टिंग के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रासायनिक संशोधनों के लागू करने के लिए इसलिए सरल है कर रहे हैं। एंटीबॉडी शारीरिक स्थितियों 15,16 तक सीमित हैं, जबकि aptamers, प्रयुक्त चयन शर्तों को संशोधित करके वांछित शर्तों के तहत उच्च लक्ष्य विशिष्टता से चयनित किया जा सकता है। इसके अलावा, aptamers वें की वजह से उच्च ligand के घनत्व में सक्षम हैंएक biosensor मंच पर दक्षता संकेत उच्च लक्ष्य है, जिसके परिणामस्वरूप छोटे आकार EIR, और aptamers का बढ़ाया स्थिरता दोहराया उपयोग और लंबे समय तक सेंसर भंडारण 16 के लिए अनुमति देता है।
Aptamers दृश्यों की एक शुरुआती पुस्तकालय लक्ष्य अणु बाध्य करने के लिए क्षमता के साथ कई (10 1 -10 2) दृश्यों से युक्त एक समृद्ध अंतिम पूल करने के लिए 10 से 13 -10 15 अद्वितीय अणुओं से विकसित किया है जिसमें SELEX, के रूप में जाना एक प्रक्रिया का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं। अंतिम समृद्ध पूल फिर अनुक्रम है, और पृथक्करण स्थिरांक (कश्मीर घ) लक्ष्य अणु के साथ उच्चतम प्रतिलिपि संख्या दृश्यों के assays के बंधन से प्राप्त कर रहे हैं। एक अंतिम समृद्ध आबादी के लिए पूल का विकास अधिक से अधिक संवर्धन प्राप्त किया जाता है, जब तक हर दौर में लक्ष्य बाध्यकारी पूल के प्रतिशत की निगरानी के द्वारा पता लगाया है। यह बाध्यकारी दृश्यों nonbinders और ampl से विभाजित कर रहे हैं, जहां विकासवादी दौर के एक नंबर, पर जगह लेता हैपोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग ified। प्रभावी ढंग से बाँधने विभाजन और बनाए रखने की क्षमता के चयन और सीधे प्रभाव चयनित aptamers 15 की विशेषताओं की दक्षता का मुख्य निर्धारकों में से एक है। वे आकार या प्रोटीन लक्ष्य 1,15 के विभाजन की प्रक्रिया में सहायता कि कार्य समूहों की विविधता के पास नहीं है के बाद से SELEX विभाजन चरण छोटे अणुओं के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण है। उदाहरण के लिए, कई प्रोटीन विभाजन प्लेटफार्मों हालांकि बाध्य डीएनए-छोटे अणु लक्ष्य परिसरों के गुणों को अप्रभावी विभाजन एक है, जिसके परिणामस्वरूप आम तौर पर nonbinding दृश्यों की तुलना में काफी अलग नहीं कर रहे हैं, आकार या आरोप-आधारित जुदाई पर भरोसा करते हैं। वैकल्पिक SELEX विभाजन के तरीकों संभवतः एक छोटे अणु के बंधन विशेषताओं में परिवर्तन है, जो स्थिरीकरण या लक्ष्य की लेबलिंग शामिल हो सकता है। छोटे अणु आर लक्ष्यों के लिए नतीजतन, एक चयन प्रक्रिया के डिजाइन aptamers उत्पन्न करने के लिएविशेष विचार equires।
संशोधनों की एक किस्म है, प्रक्रिया के विभाजन की दक्षता बढ़ाने के अंतिम पूल में दृश्यों की आत्मीयता या विशिष्टता में सुधार, या विभिन्न अनुप्रयोगों 15,16 करने के लिए इसे और अधिक उत्तरदायी बनाने के लिए मूल SELEX पद्धति को लागू किया गया है। छोटे अणुओं के लिए चयन करने में सक्षम एक SELEX संशोधन लक्ष्य अणु 17,18 के साथ बातचीत पर एक गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना है कि संरचना-स्विचिंग aptamers, या aptamers उत्पन्न करने के लिए डिजाइन किया गया था। इस पद्धति का एक उदाहरण में, पुस्तकालय चुंबकीय मोतियों 17 पर स्थिर nonbinding पूरक डीएनए के एक छोटे टुकड़े (सीडीएनए) संकरित है। लक्ष्य बाध्यकारी होने पर nonbinders सीडीएनए संकरित जबकि शेष, बंधन दृश्यों के गठनात्मक परिवर्तन / मोती चुंबकीय विभाजित और खारिज कर रहे हैं, सतह पर तैरनेवाला समाधान में उन्हें रिहा, सीडीएनए से dehybridize करने के लिए उन्हें सक्षम बनाता है। इस विधि के लाभ हैtageous छोटे अणुओं के लिए यह जुदाई को प्राप्त करने के लक्ष्य अणु का स्थिरीकरण या लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है क्योंकि।
संरचना-स्विचिंग करने में सक्षम हैं कि aptamers एक लक्ष्य अणु की उपस्थिति का पता लगाने के लिए aptamer संरचना में बदलाव की आवश्यकता है कि किसी भी संभावित biosensor प्लेटफॉर्म के लिए एक मूल्यवान सुविधा के पास है। विशेष रूप से, aptamers नमक चुनौती 19,20 के बाद लक्ष्य अणु की उपस्थिति में एक वर्णमिति प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए संरचना-स्विचिंग सिद्धांत पर आधारित है कि समारोह assays के बनाने के लिए सोने के नैनोकणों (AuNPs) के साथ जोड़ा जा सकता है। एक AuNP परख में, एकल असहाय डीएनए (ssDNA) aptamer शुरू में AuNP सतह के लिए adsorbs और नमक चुनौती से बचाता है। लक्ष्य की मौजूदगी नमक इसके बाद एक लाल-टू-नीले रंग बदलने में जिसके परिणामस्वरूप, AuNP सतह को उजागर करता है कि aptamer में एक गठनात्मक परिवर्तन लाती है। AuNP assays के भी संकेत है, जहां micromolar आत्मीयता aptamer बढ़ाना दिखाया गया हैएस हदबंदी लगातार (कश्मीर डी) 21 से कम परिमाण के स्तर के आदेश पर लक्ष्य का पता लगाने कर सकते हैं। यह सुविधा समानताएं आम तौर पर कम micromolar से millimolar सांद्रता 1,15 करने के लिए सीमा जहां छोटे अणु लक्ष्य, के लिए विशेष रूप से आकर्षक है। आम तौर पर, परख biosensor का पता लगाने के प्लेटफॉर्म के रूप में aptamer-AuNP assays के आगे के अध्ययन को प्रोत्साहित करने, प्रदर्शन करने के लिए भी तेजी से और अपेक्षाकृत सरल है।
इस काम के लक्ष्य के लिए एक प्रतिनिधि अणु के रूप में तनाव मार्कर कोर्टिसोल का उपयोग कर biosensing अनुप्रयोगों के लिए छोटे अणुओं की संरचना-स्विचिंग aptamers के चयन के लिए एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। एक AuNP biosensor का पता लगाने के योजना की वजह से आपरेशन और वर्णमिति readout की अपनी सादगी के लिए ब्याज की है, लेकिन संरचना-स्विचिंग aptamers ऐसे भी aptamer conformatio में एक परिवर्तन के माध्यम से पता लगाने प्रदान करते हैं कि विद्युत रासायनिक 22 या प्रतिदीप्ति 23 के रूप में वैकल्पिक संवेदन मंच outputs है, को लागू कर रहे हैंलक्ष्य पर एन बाध्यकारी। पिछले विधियों की तुलना में, कई नकारात्मक चयन चरणों डिजाइन 17,18 में शामिल थे, और एक साधारण यूवी-आधारित संवर्धन का पता लगाने स्कीम (चित्रा 1) लागू किया गया था। इस प्रोटोकॉल विरासत विधियों 17 में इस्तेमाल किया radioligand संवर्धन का पता लगाने के योजना के साथ विपरीत में है। प्रस्तावित विधि को भी अधिक से अधिक संवर्धन 24 मनाया गया के बाद धुन को प्रभावी ढंग से चयन की तंगी विभाजन दक्षता बढ़ाने के लिए और करने के लिए चयन में इस्तेमाल सीडीएनए कब्जा जांच की लंबाई में वृद्धि शामिल है। tuned तंगी अंतिम पूल में लक्ष्य से eluted डीएनए के एक कम कुल प्रतिशत का कारण है, लेकिन एक पहले दौर से उच्चतम प्रतिलिपि संख्या अनुक्रम की तुलना में बढ़ाया आत्मीयता के साथ ही एक दृश्य है कि के उच्च प्रतिलिपि संख्या में हुई। अंतिम पूल से उच्चतम प्रतिलिपि संख्या अनुक्रम अनुक्रम एक मंच करने के लिए उत्तरदायी था कि बताने के लिए एक AuNP परख करने के लिए लागू किया गया थाकि बाध्यकारी लक्ष्य इंगित करने के लिए एक संरचनात्मक परिवर्तन की आवश्यकता है। इस बफर आधारित परख AuNP परख की प्रतिक्रिया सतह पर लागू डीएनए के घनत्व को बदलने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है कि पता चलता है, और सबूत की सिद्धांत काम में छोटे अणु aptamer आधारित AuNP biosensors के विकास की ओर भविष्य के अनुसंधान के प्रयासों को समर्पित करने के लिए के रूप में कार्य करता है शारीरिक तरल पदार्थ।
छोटे अणुओं जैविक ब्याज की हैं, लेकिन केवल सूचना दी सब aptamers के 19% का गठन तथ्य यह है कि महान महत्व के छोटे अणुओं को लागू कर रहे हैं कि aptamers के चयन के लिए डिजाइन तरीकों प्रदान करता है। छोटे अणुओं की SELEX प्रोटीन एक की तुलना में दृश्यों के साथ बातचीत के लिए उपलब्ध हैं कम कार्य समूहों, संरचनात्मक रूपांकनों, और सतह क्षेत्र के रूप में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है, और यह प्रयास किया सभी लक्ष्यों के लिए चयन की 30% से कम एक aptamer में हुई है कि अनुमान लगाया गया है 38। इसलिए, एक सफलतापूर्वक एक छोटा सा अणु लक्षित करने के लिए एक aptamer चयन करने के क्रम में प्रयोगात्मक डिजाइन और निष्पादन की असाधारण बारे में पता होना चाहिए।
यह उनके बाध्यकारी गुण बदल सकता है जो किसी भी रासायनिक संशोधन की आवश्यकता के बिना छोटे अणुओं के लिए लागू है, क्योंकि इस काम में वर्णित aptamer चयन विधि फायदेमंद है। यह भी टी के बाद से जिसका मतलब है कि आधारित क्षालन है,ब्याज की अणु को बाँधने सतह पर तैरनेवाला बफर में जारी कर रहे हैं क्योंकि वह डीएनए, बल्कि लक्ष्य की तुलना में, शुरू में मनका मैट्रिक्स के साथ बातचीत के डीएनए चयन के अगले दौर के लिए परिलक्षित नहीं किया जाएगा, तो लक्ष्य से चुंबकीय मोतियों से eluted ही है और अविशिष्ट मैट्रिक्स बाँधने बाध्य रहते हैं। इसके विपरीत, मैट्रिक्स के खिलाफ एक नकारात्मक चयन विधि मैट्रिक्स के साथ सूचना का आदान कि डीएनए लक्ष्य बाँधने एक के अलावा परिलक्षित हो जाएगा क्योंकि ठोस समर्थन करने के लिए प्रत्येक दौर लक्ष्य स्थिर है कि तरीकों के लिए आवश्यक है। वर्तमान पद्धति एक टी एम सीमित चयन रणनीति के रूप में डिजाइन किया गया था। इस सीडीएनए / पूल संकरण की टी एम आर टी के करीब रखा गया था कि इसका मतलब है। मोर्स एक समान रणनीति का प्रयोग किया है, लेकिन 4 डिग्री सेल्सियस 17 में चयन शर्तों के साथ एक टी एम <10 डिग्री सेल्सियस के साथ एक 6-मेर सीडीएनए जांच लागू होता है। हमारे आवेदन आरटी पर प्रदर्शन किया biosensing परख के लिए था, इसलिए सीडीएनए की लंबाई के अनुसार समायोजित किया गयाly है। लक्ष्य बाध्यकारी बातचीत बाध्यकारी सीडीएनए में खलल न डालें के लिए सक्षम एक गठनात्मक परिवर्तन के लिए प्रेरित नहीं करता है एक दूरस्थ स्थान में होता है क्योंकि संभावित बाँधने नहीं खो रहे हैं इतना है कि यह काफी कम चयन की तंगी रहती है। कुछ दृश्यों केवल ऊष्मा के आधार पर dehybridize होगा क्योंकि हालांकि, प्रस्तावित विधि के विभाजन की क्षमता कम है। 15-पूर्व के टी एम एक छोटा सा अणु लक्ष्य से एक रिलीज की अनुमति के लिए बहुत अधिक थी क्योंकि इसके विपरीत, Nutiu एट अल। एक 15-मेर सीडीएनए लागू है, और केवल संभवतः, चार लक्ष्यों में से दो के लिए aptamers की पहचान करने में सक्षम थे 18। इसलिए, वर्तमान चयन रणनीति चयन की तंगी को नियंत्रित करने और सफलता की संभावना बढ़ जाएगा संभावित बाँधने के नुकसान को कम करके, पृष्ठभूमि दृश्यों को हटाने के लिए कई दौर की आवश्यकता होगी, जबकि।
Aptamer चयन करने के लिए नए कई शोधकर्ताओं की पीसीआर से संबंधित महत्वपूर्ण पहलुओं में से अनजान हैंसंभावित बाँधने। डीएनए पुस्तकालयों की ओवर-प्रवर्धन द्वारा उत्पादों उच्च चक्र संख्या में (आकार में आम तौर पर बड़ा) अवांछित पैदा करता है, और वांछित उत्पाद पूरी तरह से केवल 5 चक्रों 39 की एक अतिरिक्त के साथ गायब हो सकता है क्योंकि साइकिल अनुकूलन (खंड 4.5) के लिए आवश्यक है। ओवर-प्रवर्धन के मामले में, पीसीआर उत्पादों नहीं रह लक्ष्य से eluted उन दृश्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और चयन सफलता की संभावना काफी कम हो जाता है। 4 इस काम में 5 दौर से चक्र अनुकूलन का एक उदाहरण दिखाता है चित्रा। सबसे कम चक्र एक न्यूनतम उत्पाद बैंड, 8 चक्र के माध्यम से राशि में बैंड बढ़ जाती है पैदा करता है; 10 चक्र में बैंड एक उच्च आकार से अधिक प्रवर्धन उत्पाद के लिए एक संक्रमण शुरू होता है, और लगभग पूरी तरह से 12 चक्रों के भीतर खत्म हो प्रवर्धित उत्पाद के शामिल है। कई शोधकर्ताओं को नजरअंदाज कर सकते SELEX में अनुभवहीन है कि एक और विस्तार पूरे पूल बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रवर्धन में परिलक्षित होना चाहिए कि एफआईआर में (धारा 4.6) हैसेंट दौर बाँधने के नुकसान को कम करने के लिए। oligonucleotides से संभव अद्वितीय दृश्यों की संख्या चार चार न्यूक्लिक एसिड अड्डों का प्रतिनिधित्व करता है, जहां चार एन, है, और एन पुस्तकालय के यादृच्छिक क्षेत्र में अपने अड्डों की संख्या है। 1.2 एक्स 10 24 संभव अद्वितीय दृश्यों के दृश्यों अंतरिक्ष में जिसके परिणामस्वरूप इस काम, एन = 40, के लिए। चयन के पहले दौर में इस्तेमाल किया पुस्तकालय का 2.5 nmol मेल खाती करने के लिए ~ 10 से 15 अणु, डीएनए के प्रत्येक प्रतिलिपि संभावना एक अनूठा दृश्य के रूप में प्रारंभिक पूल में प्रतिनिधित्व किया है जिसका अर्थ है कि। इसलिए, लक्ष्य से मोतियों से eluted डीएनए की पूरी मात्रा चयन के अगले दौर के लिए प्रत्येक संभावित बांधने की मशीन की एक प्रतिलिपि बनाए रखने के लिए परिलक्षित होना चाहिए। इस प्रारंभिक प्रवर्धन हुई है एक बार, कई प्रतियां एक समरूप समाधान नमूना लेने के लिए माना जाता है, जहां निम्न राउंड में चयन के लिए उपलब्ध हैं।
लक्ष्य की एकाग्रता भी ध्यान से हर दौर में विचार किया जाना चाहिए। Nutiu एट अल। उपयोगदा चयन प्रक्रिया के दौरान 1 मिमी लक्ष्य की एकाग्रता, और कश्मीर डी = 600 माइक्रोन 18 के साथ एक एटीपी aptamer का चयन किया। मौजूदा काम और मोर्स 17 के अनुसंधान दोनों के चयन के पाठ्यक्रम में कम है, 100 माइक्रोन लक्ष्य के साथ शुरू हुआ, और कम micromolar समानताएं साथ aptamers में हुई। वास्तव में तंगी के दौर (कम लक्ष्य एकाग्रता) संवर्धन मनाया जाता है जब इस पर निर्भर करता वृद्धि की जानी चाहिए। एक और महत्वपूर्ण कदम aptamers लक्ष्य अणु को विशिष्टता का प्रदर्शन तो उचित नकारात्मक चयन चरणों को लागू करने के लिए है। नियंत्रण का उपयोग किया जाता है जिसमें चयनित aptamer का इरादा आवेदन पर प्रासंगिक है। उदाहरण के लिए, aptamer 15-1 कोर्टिसोल के लिए एक biosensing परख में एक मान्यता तत्व के रूप में कार्य करने के लिए डिजाइन किया गया था, तो यह शारीरिक तरल पदार्थ 40 में पाया जाता है कि कोर्टिसोल के लिए एक चयापचय अग्रदूत है क्योंकि प्रोजेस्टेरोन एक नकारात्मक चयन अणु के रूप में इस्तेमाल किया गया था। Nutiu एट अल द्वारा चयनित एटीपी aptamer। </ Em> एक नकारात्मक चयन कदम शामिल हैं, और ADP, एएमपी, एडेनोसाइन, और dATP 18 सहित structurally समान अणुओं के साथ सूचना का आदान प्रदान नहीं किया।
विचार के लिए एक अंतिम ध्यान दें AuNP परख अक्सर प्रत्येक aptamer / लक्ष्य जोड़ी के लिए काफी अनुकूलन की आवश्यकता है। नमक के बाद इसके अलावा एक नीले रंग की ओर एक मुश्किल से नेत्रहीन महत्त्वपूर्ण बदलाव लाती है कि नमक की मात्रा के लिए खोज एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन प्रारंभिक बिंदु के समायोजन के लिए एक प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है। हम यह भी परख (बफर एकाग्रता (buffers की उच्च नमक एकाग्रता अक्सर एकत्रीकरण का कारण बनता है क्योंकि चयन बफर कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है) और रचना, डीएनए कवरेज की डिग्री (चित्रा 3), नमूना तैयार करने पर कुछ जैविक आधार काफी अलग प्रतिक्रिया पैदा करता है कि मिल गया है लक्ष्य को भंग करने के लिए इस्तेमाल सॉल्वैंट्स एक उच्च मास्क प्रतिक्रिया है कि लक्ष्य पृष्ठभूमि), तापमान, नमक के प्रकार और एकाग्रता, और incuba कारण हो सकता है(AuNP और लक्ष्य के साथ डीएनए / AuNP के साथ दोनों डीएनए के) tion के समय। पूरी तरह से अनुकूलित शर्तों के तहत, परिणाम आम तौर पर AuNP biosensing मंच की एक तेजी से लक्ष्य प्रतिक्रिया के लाभ का प्रदर्शन, एक लक्ष्य ऊष्मायन समय <5 मिनट के साथ मनाया जाता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 aptamer की ऊष्मायन समय में / AuNP कदम 30 मिनट के लिए ओ से / एन (चित्रा 3) कम हो गया था, और नमक तुरंत (<10 सेकंड) लक्ष्य के बाद इसके अलावा बजाय 20 मिनट के बाद (चित्रा 3 जोड़ा गया है ) 73 डी / एन पी के एक लोडिंग घनत्व पर। यह पिछले शर्तों (चित्रा 3) का उपयोग कर 40% ~ बनाम 10 माइक्रोन लक्ष्य एकाग्रता में कोर्टिसोल प्रतिक्रिया के लिए ~ रिक्त (चित्रा 5 ए) की तुलना में 82% अधिक वृद्धि हुई है। यह प्रतिक्रिया नग्न आंखों (चित्रा 5 ब) के साथ प्रतिष्ठित किया जा सकता है। कोर्टिसोल का पता लगाने के रैखिक सीमा, पिछले शर्तों का उपयोग कर इन शर्तों के एक वांछित के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, सुझाव है कि तुलना में अलग है कि नोटअनुसंधान का विस्तार। Cholic एसिड और 2-methoxynaphthalene (2MNP) नियंत्रण एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया (आंकड़े 5A-बी) का उत्पादन नहीं किया। शोधकर्ताओं ने इन ऊष्मायन समय को कम करने के लिए समग्र बढ़ाया संकेत (लक्ष्य) या पृष्ठभूमि (गैर लक्ष्य अणुओं) के लिए योगदान कर सकते हैं जो AuNP सतह के साथ analytes की वृद्धि की प्रतिक्रिया की सुविधा हो सकती है कि बारे में पता होना चाहिए। इसलिए, सावधान AuNP परख डिजाइन और प्रदर्शन के लक्षण वर्णन प्रत्येक aptamer / लक्ष्य जोड़ी के लिए आवश्यक है।
इस प्रक्रिया के लक्ष्य की उपस्थिति का पता लगाने के लिए डीएनए के एक गठनात्मक परिवर्तन की आवश्यकता होती है, जो इस तरह वर्णित AuNP परख के रूप में एक biosensing मंच में समारोह में कहा कि छोटे अणु संरचना-स्विचिंग aptamers को चुनने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हालांकि, इस पद्धति के लगभग किसी भी आकार के लक्ष्य के लिए एक ही आधार पर समारोह में कहा कि इस तरह के विद्युत रासायनिक या प्रतिदीप्ति के रूप में अन्य biosensor सिस्टम को लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की शक्ति आगे से प्रयोगात्मक विकसित किया जा सकताकई दृष्टिकोण। सबसे पहले, चयन में ही संभवतः इस तरह की राशि को कम करने के लिए काफी मजबूत है, अभी तक एक छोटा सा अणु लक्ष्य के साथ बातचीत करने के लिए पर्याप्त रूप से कमजोर है कि एक बातचीत प्रदान करता है कि सीडीएनए / पुस्तकालय संकरण की आदर्श टी एम के निर्धारण के रूप में अनुकूलन के तरीकों की जांच से सुधार किया जा सकता है पृष्ठभूमि के दृश्यों ऊष्मा से केवल dehybridized। यह श्रम में समय की बचत और अभिकर्मक की खपत को कम करने, चयन के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या गाढ़ा होगा। चयन करने के लिए संशोधन में आगे की जांच के दृश्यों की एक विविध जनसंख्या विशेष रूप से प्रारंभिक दौर में लक्ष्य से अवगत कराया है कि इतनी माला और डीएनए की सबसे अनुकूल सांद्रता निर्धारित करने के लिए किया जाएगा। इन प्रमाण-की-सिद्धांत प्रयोगों की सफलता के अनुकूलन और शारीरिक तरल पदार्थ को AuNP बफर परख आदत डाल करने की दिशा में आगे संसाधनों का निवेश करने के लिए एक आधार प्रदान करते हैं। एक तेजी से, मजबूत biosensing प्लेटफॉर्म के लिए एक वैध की जरूरत है कि फू सकता हैnction मानव सीरम में AuNP परख के एक एक व्यक्ति की शारीरिक स्थिति के नैदानिक उपकरण, और आगे के विकास के रूप में, पसीना, या लार एक इस मौजूदा खाई को पूरा करेगा।
The authors have nothing to disclose.
This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dynabeads M280 Streptavidin | Invitrogen | 112.06D | Compatible with DynaMag-2 Magnet |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin |
Streptavidin Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5113-01 | This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | ≥98% |
Progesterone | Sigma | P0130 | ≥99% |
Cholic Acid | Sigma | C1129 | ≥98% |
NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | ND-1000 | Replaced by ND-2000 model |
Tris Base | Promega | H5135 | ≥99.9% |
Sodium Chloride | Sigma | S9888 | ≥99.5% |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% |
500 mL Filter System | Corning | 430769 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
DNA Library | Operon | Custom | HPLC purified |
All other DNA | IDT | Custom | Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC |
Thermomixer | Eppendorf | R | Any model with temperature and mixing speed control will work |
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn | Agilent | 600674 | Taq polymerase can be used as well |
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade | Agilent | 200415 | Other brands will work here |
10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer | Agilent | 200532 | This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase |
GeneAmp PCR System | Applied Biosystems | 9700 | Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work |
Agarose-LE | Ambion | AM9040 | ≥99.9% |
Ethidium Bromide | Sigma | E-1510 | Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen |
Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style | Glen Research | 20-0021-01 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe |
Replacement Filters Expedite | Glen Research | 20-0021-0F | 1 µm size |
Illustra NAP-25 Columns | GE Healthcare | 17-0852-01 | Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | ThermoFisher Scientific | 66205 | 2k MWCO used |
Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important |
Sodium Citrate Dihydrate | SAFC | W302600 | We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays |
SpectraMax | Molecular Devices | M5 | Results were similar to Bio-TEK system |
Synergy | Bio-TEK | HT | Results were similar to Molecular Devices system |
HEPES Buffer | Amresco | J848 | Any brand that makes a sterilized product will work |
250 mL Filter System | Corning | 430767 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Other brands will work here |
5 mL Syringe | Becton-Dickinson | 309646 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column |
ThermoEC Minicell Primo | ThermoFisher Scientific | EC320 | Compatible with Power Supply |
Power Supply | Fisher Scientific | FB300 | Compatible with ThermoEC Minicell Primo |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | Flammable liquid |
2 Methoxynaphthalene | Sigma | 148245 | 99% |
Assay Plate | Corning | 3370 | 96-well Flat Bottom, Sterile |