Immunhistokjemi og Multiple merking med antistoffer fra samme vert Arter å studere Voksen hippocampus Neurogenesis
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
Voksen nevrogenesen er et meget regulert, flertrinns prosess hvor nye neuroner er generert fra et aktivert neural stamcelle via stadig engasjerte mellom progenitor subtyper. Hver av disse undertypene uttrykker et sett av spesifikke molekylære markører som, sammen med bestemte morfologiske kriterier, kan brukes for deres identifisering. Vanligvis blir immunofluorescerende teknikker anvendt involverer subtype-spesifikke antistoffer i kombinasjon med ekso- eller endogene sprednings markører. Vi her beskrive immunolabeling metoder for påvisning og kvantifisering av alle stadier av voksen hippocampus neurogenesis. Disse omfatter bruk av tymidin-analoger, transcardial perfusjon, vev behandling, varme-indusert epitope henting, ABC immunhistokjemi, flere indirekte immunfluorescens, konfokal mikroskopi og celle kvantifisering. Videre kan vi presentere en sekvensiell multippel immunfluorescens protokoll som omgår problemene usually som følge av behovet for å bruke primære antistoffer dannet i de samme vertsarter. Den lar en nøyaktig identifikasjon av alle hippocampus progenitor undergrupper sammen med en spredning markør innenfor en enkelt seksjon. Disse teknikkene er et kraftig verktøy for å studere regulering av ulike progenitor subtyper parallelt, deres engasjement i hjernesykdommer og deres rolle i spesifikke hjernefunksjoner.
Introduction
To hjerneregioner konstitutivt generere nye nerveceller gjennom hele livet, subventricular sonen av de laterale ventrikler og subgranular sone (SGZ) av hippocampal dentate gyrus (DG). De nyfødte nerveceller stammer fra nevrale stamceller og gå gjennom ulike stadier av morfologiske og fysiologiske utvikling før de når modenhet 1,2. Fra en sakte dele radial gliaceller-lignende stamcelle (type 1) stadier i transitt forsterke mellom stamceller oppstår. De mer udifferensierte undergrupper (type 2a og type 2b) har en uregelmessig form med korte, tangentielle prosesser. De genererer neuroblasts (type 3) som gradvis avslutte cellesyklus til å bli umodne nerveceller (med dendritter utvidet mot molekylær lag) og til slutt integreres i hippocampus nettverk som modne granule celler. På grunn av sine spesielle fysiologiske egenskaper disse cellene gi kretsene med forbedrede plastisitet 3 forslagting en unik rolle i hippocampus funksjon. Egentlig studier av det siste tiåret generert betydelig bevis for at voksen neurogenesis bidrar til romlig minne, mønster separasjon og emosjonelle oppførsel 4,5.
Voksen neurogenesis kan studeres ved hjelp av ulike tilnærminger. Tymidin analoger innlemme i DNA i S-fasen av cellesyklus og tillater fødsel dateres, kvantifisering og skjebnen analyse av nyfødte celler 6-8. Sekvensiell anvendelse av ulike tymidin-analoger (f.eks CldU, Edu eller IDU) kan brukes til å studere cellefornyelsen eller celle populasjoner født ved ulike tidspunkt i løpet av et eksperiment 9. En alternativ, endogen markør for celleformering er Ki67. Den er uttrykt i delende celler i alle faser av cellesyklusen (G1, S og G2, M), bortsett fra hvilefase (G0) og begynnelsen av G1 10,11. For å analysere fenotypen av nyfødte cellepopulasjoner i voksen dentate gyrus flere scene-spesifikke molekylære markører kan brukes som GFAP, nestin, DCX og Neun 1,6. GFAP er en markør for modne astrocytter men kommer også til uttrykk i radial gliaceller-lignende celler i voksen forhjerne. Nestin er et mellomliggende filament spesifikk for radiale gliaceller-lignende celler og tidlig mellom stamceller. DCX er en microtubule-assosiert protein uttrykt i mellom stamceller, neuroblasts og umodne nerveceller. Basert på (med) uttrykk for disse tre markørene og morfologiske trekk ved de merkede cellene fire distinkte stamcelle subtyper kan identifiseres: type 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), type 2a (GFAP -, nestin + , DCX -), type 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) og type 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-merking av DCX sammen med Neun, som er uttrykt i postmitotic neuroner, tillater differensiering av immature (DCX +, Neun +) og moden (DCX -, Neun +) granule nevroner.
De ovenfor nevnte markører blir ofte brukt for immunofluorescerende co-merking og påfølgende konfokal mikroskopi for å analysere antallet og identiteten til nyfødte celler. Dette krever vanligvis antistoffer fra ulike vertsarter for å hindre uønsket antistoff kryssreaktivitet. Imidlertid er de fleste av primære antistoffer egnet for neurogenesis forskning hevet enten i kaniner eller mus (f.eks muse α-BrdU, mus α-Neun, kanin α-Ki67, kanin α-GFAP). Dette fører til alvorlige begrensninger i antall og kombinasjoner av antigener som kan bli evaluert i et enkelt stykke. Dette i sin tur øker ikke bare flekker innsats, som flere stainings må utføres, men kan også svekke påliteligheten av resultatene. Videre har en del antigenene er utsatt for fiksering formalin-indusert epitop maskering (f.eks Ki67, Nestin). Vi her beskriver endringer fra de klassiske en- og fler immunolabeling protokoller (f.eks epitope henting, multippel sekvensiell farging, bruk av nestin-GFP transgene mus 12) som overvinne mange av disse spørsmålene. Særlig gjør den sekvensielle flere immunfluorescens protokollen flekker mot opptil fire forskjellige antigener selv om en del av antistoffene er avledet fra den samme vert. Dette muliggjør simultan deteksjon av type 1, type 2a, 2b typen og type 3-progenitorceller, så vel som deres proliferativ aktivitet i et enkelt avsnitt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantifisering og identifisering av subpopulasjoner av nyfødte celler er et sentralt tema i voksen neurogenesis forskning. Kombinere spredning markører og antistoffer mot proteiner uttrykt under bestemte stadier av voksen neurogenesis tillater immunhistokjemisk påvisning av disse undergruppene. Noen av antistoffer eller antistoff-kombinasjoner krever bestemte fargingsbetingelser.
Merking av dele celler med syntetisk tymidin-analoger er fortsatt gullstandarden for å studere voksen hippoca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
