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Immunology and Infection

フォワード遺伝学は、識別するためのマクロファージを使用した画面<em>トキソプラズマ</emIFN-γ依存性細胞自律イミュニティへの抵抗のための重要な>遺伝子

Published: March 12, 2015
doi:
10.3791/52556
, , , , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,New York Medical College

Summary

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Abstract

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in naïve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Introduction

トキソプラズマトキソプラズマ（トキソプラズマ）は偏性細胞内、原生動物病原体である。それは、トキソプラズマ症の原因物質、免疫無防備状態の個体における健康被害である。また、 クリプトスポリジウム及びシクロスポラ含むヒトに感染する他のアピコンプレクサの病原体についてのモデル系である。トキソプラズマ症は、最も一般的に寄生虫ブラディゾイトまたはオーシスト段階で汚染された食物または水の摂取を介して取得される。摂取時には、これらのステージは、宿主細胞内で複製し、全身に広める寄生虫のタキゾイトステージに変換する。 T細胞は、IFN-γ、および、より少ない程度に、窒素酸化物1-4は 、感染症の制御に重要であるが、タキゾイトの割合が組織嚢内で保護されブラディゾイト期に変換するように、疾患を排除することができない長命の慢性感染症になる。実際には、全く治療薬は慢性シストSに対して効果はありません病気の田下。重度のトキソプラズマ症は、プライマリおよび急性感染の急速複製タキゾイト段階特性に戻って変換する寄生虫のブラディゾイト期で、起因する持続感染の再活性化に最も頻繁にある。

先天性免疫応答の面で初期の生存は、寄生虫が十分な寄生虫数に到達するため、ならびに慢性感染症の確立を可能にするために、遠位部位に到達させることが重要である。T.トキソプラズマは、おそらく複製し、感染の早期普及する能力に貢献する宿主防御機構に対抗するための戦略を発展させてきました。まず、T。トキソプラズマは、他の細胞内病原体5-9と比べて、宿主細胞のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスのプロセスから大幅に偏析する寄生虫の侵入時にユニークなPVを形成している。また、成功したすべての細胞内病原体のようなT.トキソプラズマは、許容される環境fを作成するために、その宿主細胞を修飾するまたは成長。これは、細胞活性化10-15を調節するための重要なものを含む宿主細胞の転写因子を変更することによって再プログラミング宿主細胞遺伝子発現を含む。 ROP16 16-19は 、GRA15 20、GRA16 21とGRA24 22はすべてT.感染した宿主細胞のシグナル伝達カスケード転写応答及び細胞の調節に重要であることが示されているトキソプラズマ 。明確な表現型を有する寄生虫株の間遺伝的交雑を用いた最近の研究では、免疫関連GTPアーゼ（IRGs）16,19,23-26の回避などの寄生虫の遺伝子型に依存する特性の基礎となる寄生虫の遺伝子の同定に生産性の高いされている。非常に毒性の強いタイプIの遺伝子型は、マウスIRGsを回避する機構を進化させてきたが、マウスでは、免疫関連GTPアーゼ（IRGs）は、寄生虫のタイプIIおよびIIIの遺伝子型の制御のために重要である。しかし、寄生虫抗菌メディアを回避する機構を進化させていることも明らかであるIRGsに加えて、これらのメカニズムのいくつかは、寄生虫の遺伝子型27,28を越えて保存されるよう役。また、非常に少ないが、Tに対する細胞自律的な免疫の重要なメディエーターについてはほとんど知られていない人間のトキソプラズマ症の間にトキソプラズマ 。細胞自律的な免疫のメディエーターへの抵抗のために重要な寄生虫の遺伝子はまた、宿主の免疫応答によってトリガすることが可能な変換をブラディゾイトするタキゾイト中に生存のために重要であるかもしれない。例えば、高いレベルでの一酸化窒素は、感染したマクロファージにおける寄生虫の複製を抑制することができるが、それはまた、嚢胞の生産30-32、結果の変換をブラディゾイトするタキゾイトを刺 ​​激することができる。

ToxoDBはT.のための機能的なゲノムデータベースですトキソプラズマ 、そのコミュニティの注釈を含む公開され、未発表のゲノムスケールのデータにシーケンス寄生虫ゲノムの情報およびアクセスを提供するという点でフィールドの重要なリソースとして機能し、遺伝子EXP ressionとプロテオミクスデータ33。多くの原生動物の病原体と同様に、ゲノムの大半は彼らのポテンシャル関数への洞察を提供するために、遺伝子の相同性に基づいて、利用可能な情報がないとの仮定の遺伝子からなる。このように、フォワード遺伝学は免疫回避、嚢胞変換や寄生虫病因に重要な他の機能のためだけでなく、個別の発達段階との間の変換のための重要な新規寄生虫遺伝子を同定するための強力なツールです。フォワード遺伝学のさらなる長所は、免疫回避及び嚢胞形成を含む病因における特定のタスクのために重要な遺伝子のような寄生虫を調べるために、比較的偏りのないアプローチとして使用することができることである。突然変異プロファイリングのための次世代の配列決定における最近の改善は、化学的および挿入突然変異34-37の両方を用いた順遺伝学研究から責任寄生虫遺伝子を同定するための選択方法で行った。

ntent ">それは、寄生虫に対する細胞自律的な免疫機構にも耐性の嚢胞段階に対して活性であり得ることを特にの実効性を高めるために活用することができトキソプラズマの脆弱性を特定することが重要である。この目的に向けて、in vitroでネズミマクロファージ感染と活性化モデルは、具体的にナイーブマクロファージ内で感染したマクロファージの活性化に続いてではなく、 トキソプラズマの適応度を損なう寄生虫に変異を同定するために開発されました。このマクロファージ画面は、最終的にするために、 トキソプラズマ挿入変異体のライブラリーを調べるために使用された一酸化窒素27,28への抵抗のための重要なトキソプラズマ遺伝子を同定する。感染したマクロファージの活性化に損なわれた抵抗性を有するトキソプラズマ変異体のパネルの単離、一酸化窒素に特に顕著な感度は、識別するために、画面の有用性を証明した抵抗のための重要な寄生虫の遺伝子ネズミIRGs 28について記載した耐性機構以外の細胞自律的な免疫のメディエーターに。挿入変異誘発は、制限されたそれぞれの寄生虫クローンにおけるランダム変異の数と、理論的には、突然変異の部位をより容易に識別を生成するという点で化学的突然変異誘発を超える利点を有している。しかし、Tのプラスミド挿入のゲノム部位を特定するトキソプラズマ挿入変異体は、実際には、多くの場合、37で、驚くべきことには困難であった。遺伝子へのプラスミドの挿入は、典型的には、単一のヌクレオチド変化をもたらす化学的突然変異誘発とは対照的に、遺伝子の機能を破壊する可能性がある。それは、複数の一塩基多型を作成しかし、化学的突然変異誘発は、N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）、またはエチルメタンスルホン酸（EMS）のいずれかで（、挿入突然変異と比較して、寄生虫のゲノムの大部分を分析する能力の増加を提供することができる突然変異体34あたり10 -100）と見積もら、38。また、全ゲノムプロファイリングの最近の進歩により、変異した寄生虫34,38の識別された表現型に関与する可能性が最も高い候補遺伝子を同定するために、次世代シークエンシングを使用するようになった。かかわらず、変異誘発アプローチの、マクロファージ活性化に抵抗の寄生虫遺伝子の役割の確認は最終的に、分子コッホの仮説を満たすために遺伝子欠失および相補性を必要とします。

寄生虫とマクロファージの両方の遺伝子操作によって遺伝子の機能を分析する能力は、Tに前進遺伝学を経由して同定された遺伝子の多くが同様に重要であるトキソプラズマ原虫、ならびに他の病原体は、まだ既知の機能を有する他のタンパク質と全く配列相同性をほとんどと仮定的遺伝子として特徴づけられる。現在の紙は、変異体において破壊された遺伝子は、既知のまたはそれに抵抗するために重要であるかどうかを識別するために使用できる一般的なアプローチを概説細胞自律的な免疫の未知の仲介者。ホスト抗菌因子の初期分析は、野生型および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）のgp-91 phoxの（NADPHオキシダーゼ）における特定の遺伝子欠失を有するものに対して、野生型マウス由来のマクロファージにおける変異寄生虫の生存を評価することによって行われ、特異免疫関連分子量GTPase（IRGs）。識別された寄生虫の遺伝子は、一酸化窒素、反応性酸素中間体または免疫関連分子量GTPase 28それぞれまたは未知の免疫機構が関与している場合への抵抗のために重要である場合、これが決定されます。現在のプロトコルに記載されてIFN-γ及びLPSの両方に感染したマクロファージの活性化は、主に一酸化窒素28への抵抗のために重要な寄生虫遺伝子の単離をもたらす。マクロファージ活性化の非存在下で一酸化窒素を誘導する薬理学的薬剤の使用は、（一酸化窒素供与体）が同定された遺伝子の大部分は再ために重要であることが確認されたマクロファージ活性化28に関連する追加メディエーターと協調して一酸化窒素のではなく、一酸化窒素にsistance。

ステップ1と2は、in vitroで感染した骨髄由来マクロファージの活性化に続いてフィットネスの欠陥とは寄生虫の変異体を分離するために設計されたフォワード遺伝学の画面について説明します。第一段階は、寄生虫複製を減少させるが、完全に野生型Tの複製を阻害しないマクロファージの活性化のために使用することが経験的にIFN-γの用量を決定するために、用量滴定分析を説明し、LPS寄生虫の変異体のライブラリーを作成するために使用されるトキソプラズマ親株。ステップ2は、96ウェルプレート中のマクロファージにおける変異クローンのフォワード遺伝子スクリーニングを説明しています。ステップ3は、96ウェルプレートのスクリーニングで同定された各変異体の表現型を確認し、各変異体に欠陥が寄生虫の生存に影響を及ぼすかどうかを評価するために、複製アプローチを概説マクロファージ活性化に応答して、または嚢胞製造。ステップ4つの寄生虫変異体が特に影響を受けやすいれる免疫メディエーターを同定するための特定の抗菌経路の欠失を有するマウスからの骨髄由来マクロファージの使用を記載している。ステップ5は、感染したマウスの脳内シスト生産によって評価される寄生虫の変異体はまた、インビボ病因のために危険にさらされているかどうかを判断するためのアプローチの概要を説明します。

Protocol

注：動物の使用を含むすべてのプロトコルは、ニューヨーク医科大学の動物実験委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。 NOTE：38希釈、マウス骨髄由来マクロファージ39の単離、T.の成長を制限することにより、化学的突然変異誘発38、寄生虫の単離のための詳細なプロトコール線維芽細胞ヒト包皮におけるトキソプラズマ （HFF）細?…

Representative Results

トキソプラズマはナイーブマクロファージ内で自由に複製し、寄生虫の株に依存6-12時間の間の倍加時間を持っています。 図1活性化した骨髄由来マクロファージに対してナイーブで代表的な寄生虫を示している。 図2は、HFFで寄生虫の一般的な形態を示す/ PV 2、4、8、16、32寄生虫で宿主細胞。現在のプロトコルでは、寄生虫はナイーブマクロファージに侵入し…

Discussion

記載されたプロトコルは、Tを分離するために、マウス骨髄由来マクロファージおよびフォワード遺伝学の活性化を使用して偏りのないアプローチを提供彼らの能力の欠陥とトキソプラズマ変異体は、感染したマクロファージの活性化を生き残るために。マクロファージ活性化に続いて突然変異体の表現型は、一般的に2つのカテゴリのいずれかに分類されます。1）寄生虫はその?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

Materials

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References

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Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).
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