En Hydrogel Construct og Fibrin-baserede Lim tilgang til levere Therapeutics i en murin myokardieinfarkt Model.

Summary

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

Abstract

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo¹. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased.

Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream^2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream⁵. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

Introduction

En myokardieinfarkt (MI) er defineret som afbrydelse af blod til et område af hjertet forårsaget af okklusion af en stor kranspulsåre. Den skader som følge af en MI skyldes ombygning af levedygtige hjertevæv til ikke-funktionel arvæv, som nedsætter hjertets evne eller mere specifikt, den venstre ventrikel, viste ordentligt. Dette resulterer i et fald i mængden af blod, der kan leveres til kroppen med hvert hjerteslag, kendt som slagvolumen, og procentdelen af blod, der pumpes ud af hjertet med hvert hjerteslag, kendt som uddrivningsfraktion ^6. Disse, sammen med andre formindskede funktioner, øger belastningen på resten af ​​hjertet til at opretholde tilstrækkelig funktion. Ofte kan denne forøgede belastning blive så alvorlig, at det forårsager en anden hjerteanfald, et fænomen ses hos ca. 10% af personer ^7.

Mens lægepraksis har udviklet sig til at behandleumiddelbart efter en MI er ingen teknik er udviklet til at standse, langsom, eller vende de negative bivirkninger af væv remodellering. Stamceller er dukket op som en mulig vej for en sådan behandling, men på trods af deres lovende potentiale, stamceller har ikke vist succes i kliniske omgivelser. En teori for deres mangler er den manglende evne til at sikre de gavnlige celler forbliver på stedet for infarkt længe nok til at frembringe gunstige resultater ^5. Det er blevet vist, at ikke mere end 24% af celler, der simpelthen injiceres i stedet for infarkt overlevede og forblev på det beskadigede site 1 dag efter levering ^2. En mulig udsigt til at behandle dette spørgsmål om celle tilbageholdelse er at udvikle biokompatible hydrogel-systemer, der indkapsler enten celler eller lægemidler, som kan leveres til den skadede lokalitet. Hydrogelen ifølge valg i denne protokol er et poly (ethylenglycol) dimethacrylat grund af sin tidligere anvendelse i celleindkapsling procedures imidlertid enhver hydrogel stand til indkapsling kan anvendes ^8. Leveringen af ​​plasteret direkte til læsionsstedet sikrer celle-til-væv kontakt over en længere tidsperiode, forøgelse af længden af ​​tid cellerne kan tilvejebringe fordelagtige faktorer til den underliggende myokardiet.

En flaskehals til plasteret fremgangsmåde er vanskeligheden ved at klæbe lappen til hjertet overflade. Mange grupper har overvundet dette gennem en række forskellige teknikker, den mest fremherskende være en simpel sutur at binde konstruktionen til hjertet overflade ^9,10. Dette har vist sig vellykket i en række tilfælde, hvor konstruktionen er fremstillet af et stivere materiale, men mislykkes, når forsøges på en hydrogel-system, på grund af den høje koncentration vand og delikat karakter af plasteret konstruktionen. For at overvinde dette, har vi udnyttet en fibrinklæber eksternt adhæsivt system, der efterligner kemien af ​​koageldannelse. Fibrinklæber har været anvendt i talrige medicinske operationer, including dura tårer, bronchiale fistler og hornhinde transplantation, fremhæver biokompatibilitet af produktet som et sår fugemasse ^11-13. Derudover har fibrin været anvendt i en række forskellige hjertelidelser formål, herunder kirurgisk behandling af venstre ventrikel bristninger og koronar bypassoperationer imidlertid dens anvendelse som en vedhæftning lim til en hjerte-plaster ikke almindeligt anvendt ^14-17. En simpel formulering af thrombin og fibrinogen resulterer i en biokompatibel lim, der kan placeres direkte på ydersiden af ​​en ydre kardial plaster, indeholdt et acceptabelt vedhæftning for at sikre patch til hjerte interaktion.

Protocol

Procedure er i fuld kompatibilitet med IACUC protokol nummer 13302 og er blevet godkendt af opdelingen af ​​animalske ressourcer. 1. Instrument Forberedelse Autoklaver alle ikke-engangs instrumenter forud for den kirurgiske procedure for at sikre sterilitet. Sterilisere instrumenter, der anvendes flere gange i en session med en glaskugle sterilisator mellem anvendelser. 2. Hydrogel Forberedelse Optø og plade stamceller m…

Representative Results

Under den kirurgiske procedure, kan ligering af venstre koronararterie identificeres ved en markant blanchering nedstrøms for den okkluderede arterie. Som en test, før binde knude, kan sutur strammes kortvarigt at kontrollere, om det er i det rigtige sted. Derudover, da okklusion af arterien resulterer i næsten øjeblikkelig fald i evnen af ​​det venstre atrium til korrekt beat, vil den venstre atrium større som svar på en tilbagestrømning af blod i systemet. M-mode ekkokardiografi…

Discussion

Med denne tilgang til den murine MI model, har vi udviklet et system, der minimerer skade på ikke-myokardiet områder, der er forbundet med andre murine MI teknikker. Disse områder omfatter skader forårsaget af en trakeostomi, skæringen af ​​muskulære lag og brud på ribberne at blotlægge brysthulen. Vi mener, at disse ændringer forbedrer de samlede kirurgiske outcome takket være draget omsorg for at bevare så meget af de store strukturer, herunder rib…

Materials

Harvard Model 687 Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 surgical microscope	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Delicate Forceps – 0.4mm Tips Angled	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor – 3.5cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Spring Scissors – 2.5mm Blades Straight	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Needle Holder – w/Lock Tungsten Carbide 14cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Scissors – Delicate Straight 10.5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament suture	Ethicon	8730P
6-0 Silk suture	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB