En Hydrogel Konstruer og fibrin basert lim tilnærming til å levere Therapeutics i en Murint hjerteinfarkt Model.

Summary

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

Abstract

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo¹. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased.

Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream^2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream⁵. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

Introduction

En hjerteinfarkt (MI) er definert som den avbrudd av blod til en region av hjertet forårsaket av okklusjon av en større koronararterie. Den skade som følge av en MI skyldes ombygging av levedyktig hjertevevet inn i ikke-funksjonell arr vev, noe som reduserer muligheten av hjerte eller, mer spesifikt, venstre ventrikkel, for å slå på riktig måte. Dette resulterer i en reduksjon i volumet av blod som kan leveres til kroppen med hvert hjerteslag, kjent som slagvolumet, og prosentandelen av blod som pumpes ut av hjertet med hvert hjerteslag, kjent som ejeksjonsfraksjon ^6. Disse, sammen med andre funksjoner redusert, øker belastningen på resten av hjertet for å opprettholde tilfredsstillende funksjon. Ofte kan denne økte belastningen bli så alvorlig at det fører til en andre hjerteinfarkt, et fenomen som sees hos omtrent 10% av individer ^7.

Mens medisinsk praksis har utviklet seg til å behandlekjølvannet av en MI har ingen teknikk er utviklet for å stanse, langsom eller reversere de negative bivirkninger av vev remodeling. Stamcelleterapi har dukket opp som en mulig vei for en slik behandling, men til tross for deres lovende potensial, stamceller har ikke vist seg vellykket i klinisk setting. En teori for sine mangler er manglende evne til å sikre de gode cellene forblir på stedet av infarkt lenge nok til å generere gode resultater ^5. Det har vist seg at ikke mer enn 24% av celler som er rett og slett injisert inn i området av infarkt overlevde og holdt seg på det skadede området 1 dag etter levering ^2. En mulig utsiktene for å ta opp dette spørsmålet om cellen oppbevaring er å utvikle biokompatible hydrogel systemer som innkapsler enten celler eller terapi, som kan leveres til det skadede området. Den hydrogel av valget i denne protokollen er en poly (etylenglykol) dimetakrylat på grunn av sin tidligere anvendelse i celle pr innkapslingocedures imidlertid noe hydrogel er i stand til innkapsling kan benyttes, ^8. Leveringen av plasteret direkte til skadestedet sikrer celle-til-vev kontakt over en lengre periode, noe som øker lengden av tiden cellene kan gi fordelaktige faktorer som til det underliggende hjertemuskelen.

En flaskehals til lappen metode er vanskeligheten med å feste plasteret til hjertet overflaten. Mange grupper har overvunnet dette ved en rekke teknikker, de mest utbredte være en enkel sutur for å binde konstruksjonen til hjertet overflaten ^9,10. Dette har vist seg vellykket i en rekke tilfeller, hvor konstruksjonen er laget av et stivere materiale, men mislykkes når forsøkes på en hydrogel system, på grunn av det høye vannkonsentrasjonen og skjøre natur plasteret konstruksjonen. For å overvinne dette har vi benyttet et fibrinlim ytre klebemiddelsystem som gjen kjemien av levringsdannelse. Fibrinlim har vært brukt i en rekke medisinske operasjoner, IncLuding dura tårer, bronkial fistler, og hornhinnetransplantasjon, fremhever biokompatibilitet av produktet som et sår tetningsmasse ^11-13. I tillegg har fibrin vært brukt i en rekke hjerte formål, blant annet kirurgisk behandling av venstre ventrikkel brudd og hjerte bypass operasjoner, derimot, er dens bruk som en vedheft lim for en hjerte patch ikke brukte ^14-17. En enkel formulering av trombin og fibrinogen resulterer i et biokompatibelt lim som kan plasseres direkte på utsiden av en ekstern hjerte lapp, som gir et levedyktig system for å sikre adhesjon til plaster hjerte interaksjon.

Protocol

Prosedyren er i full kompatibilitet med IACUC protokollnummer 13302 og har blitt godkjent av delingen av dyre ressurser. 1. Instrument Forberedelse Autoklav alle flergangs instrumenter som brukes før den kirurgiske prosedyren for å sikre sterilitet. Sterilisere instrumenter som brukes flere ganger i en sesjon med et glass perle sterilisator mellom bruker. 2. Hydrogel Forberedelse Tine og plate stamceller minst 24 timer før…

Representative Results

I løpet av den kirurgiske prosedyren, kan ligering av den venstre koronararterien identifiseres ved en markert bleking nedstrøms for det okkluderte arterie. Som en test før knytte knuten, kan sutur strammes kort for å sjekke om det er på riktig sted. I tillegg, siden okklusjon av arterien resulterer i nesten øyeblikkelig reduksjon i evnen til venstre atrium til riktig slå, vil den venstre atrium stort format som reaksjon på en tilbakestrøm av blod i systemet. M-mode ekkokardiografi …

Discussion

Med denne tilnærming til murine MI modellen har vi utviklet et system som minimaliserer skade på ikke-myokard områder som er forbundet med andre murine MI teknikker. Disse områdene omfatter skade forårsaket av et trakeostomi, kutting av muskellaget, og brudd av ribbene for å eksponere brysthulen. Vi mener at disse endringene forbedre den generelle kirurgiske utfallet takk til omtanke for å beholde så mye av de store strukturene, inkludert ribbeina og muskel…

Materials

Harvard Model 687 Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 surgical microscope	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Delicate Forceps – 0.4mm Tips Angled	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor – 3.5cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Spring Scissors – 2.5mm Blades Straight	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Needle Holder – w/Lock Tungsten Carbide 14cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Scissors – Delicate Straight 10.5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament suture	Ethicon	8730P
6-0 Silk suture	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB