En hydrogel Konstruera och Fibrin baserat lim metoden att leverera Therapeutics i en murin hjärtinfarkt modell.

Summary

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

Abstract

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo¹. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased.

Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream^2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream⁵. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

Introduction

En hjärtinfarkt (Ml) definieras som avbrott av blod till en region hos hjärtat som orsakas av ocklusion av en större kransartär. Den skada som härrör från ett Ml beror på ombyggnad av viabelt hjärtvävnad in i icke-funktionella ärrvävnad, vilket minskar möjligheten för hjärtat, eller närmare bestämt, den vänstra ventrikeln, för att slå på rätt sätt. Detta resulterar i en minskning av volymen av blod som kan levereras till kroppen med varje hjärtslag, känd som slagvolym, och andelen av blod som pumpas ut från hjärtat med varje hjärtslag, kallas ejektionsfraktion ^6. Dessa, tillsammans med andra minskat funktioner, ökar belastningen på resten av hjärtat att upprätthålla tillräcklig funktion. Ofta kan denna ökade stammen blivit så allvarlig att den orsakar en andra hjärtattack, ett fenomen ses i ca 10% av personer ^7.

Även om medicinsk praxis har utvecklats för att behandlaomedelbart efter en hjärtinfarkt, har ingen teknik utvecklats för att stoppa, långsam, eller vända den negativa biverkningar av vävnadsombildning. Stamcellsterapi har dykt upp som en möjlig väg för en sådan behandling, men trots sin lovande potential stamceller har inte visat sig framgångsrika i klinisk miljö. En teori för sina tillkortakommanden är oförmågan att se de positiva cellerna kvar på platsen för infarkt tillräckligt länge för att generera goda resultat ^5. Det har visat sig att inte mer än 24% av celler som bara injiceras i stället för infarkt levde och låg kvar på den skadade platsen 1 dag efter leverans ^2. En möjlig utsikter för att ta itu med frågan om cellkvarhållande är att utveckla biokompatibla hydrogel system som kapslar antingen celler eller läkemedel, som kan levereras till den skadade platsen. Hydrogelen val i detta protokoll är en poly (etylenglykol) dimetakrylat på grund av dess tidigare användning i cellinkapslings procedures emellertid varje hydrogel med förmåga att inkapsling kan användas ^8. Leveransen av plåstret direkt till platsen för skadan säkerställer cell-till-vävnadskontakt under en utsträckt tidsperiod, vilket ökar den tid cellerna kan ge fördelaktiga faktorer till den underliggande hjärtmuskeln.

En flaskhals för plåstret tillvägagångssättet är att det är svårt att fästa lappen till hjärtat ytan. Många grupper har övervunnit detta genom en mängd olika tekniker, den vanligaste är en enkel sutur att knyta konstruktionen till hjärtat ytan ^9,10. Detta har visat sig vara framgångsrik i ett antal fall i vilka konstruktionen är tillverkad av ett styvare material, men misslyckas när försök på en hydrogel-system, på grund av den höga vattenkoncentrationen och känsliga natur plåstret konstruktet. För att övervinna detta, har vi använt ett fibrinlim externt limsystem som efterliknar kemin för koagelbildning. Fibrinlim har använts i många medicinska operationer, including dura tårar, luftrörs fistlar och hornhinnetransplantation, med fokus på biokompatibilitet av produkten som ett sår tätningsmedel ^11-13. Dessutom har fibrin använts för en mängd olika hjärt ändamål, bland annat kirurgisk behandling av vänsterkammar spricker och koronar bypass-operationer, men dess användning som en vidhäftnings lim för en hjärt plåstret inte vanligt förekommande ^14-17. En enkel formulering av trombin och fibrinogen resulterar i en biokompatibel lim som kan placeras direkt på utsidan av en yttre hjärt plåster, vilket ger en livskraftig vidhäftning för att säkerställa plåstret till hjärt interaktion.

Protocol

Förfarandet är i full kompatibilitet med lACUC protokoll nummer 13302 och har godkänts av avdelningen av djurresurser. 1. Instrument Framställning Autoklav alla icke-engångsinstrument som används före det kirurgiska ingreppet för att säkerställa sterilitet. Sterilisera instrument som används flera gånger i en session med en glaspärla autoklav mellan användningarna. 2. Hydrogel Framställning Tina och platta stam…

Representative Results

Under den kirurgiska proceduren, kan ligering av den vänstra kransartären identifieras genom en märkt blanche nedströms den tilltäppta artären. Som ett test innan band av fnurran, kan suturen dras åt snabbt för att kontrollera om det är på en lämplig plats. Dessutom, eftersom ocklusion av artären resulterar i nästan ögonblicklig minskning i förmågan hos det vänstra förmaket för att korrekt slå, kommer det vänstra förmaket förstoring i beroende av ett backflöde av blod i systemet. <p class="jo…

Discussion

Med detta synsätt på mus MI modellen, har vi utvecklat ett system som minimerar skadan på icke-hjärtmuskulaturen områden som är förknippade med andra murina MI tekniker. Dessa områden omfattar skador som orsakats av en trakeostomi, styckning av muskelskiktet och brott revben för att exponera brösthålan. Vi tror att dessa förändringar förbättrar de övergripande kirurgiska utfall tack vare omsorg för att behålla så mycket av de stora strukturerna, …

Materials

Harvard Model 687 Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 surgical microscope	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Delicate Forceps – 0.4mm Tips Angled	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor – 3.5cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Spring Scissors – 2.5mm Blades Straight	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Needle Holder – w/Lock Tungsten Carbide 14cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Scissors – Delicate Straight 10.5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament suture	Ethicon	8730P
6-0 Silk suture	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB