गोल्ड neuronal कोशिकाओं की ऑप्टिकल उत्तेजना nanorod की सहायता

Summary

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Abstract

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

Introduction

हाल के अध्ययनों से पानी (तरंगदैर्ध्य> 1400 एनएम) द्वारा अवरक्त प्रकाश के अवशोषण के साथ जुड़े क्षणिक हीटिंग तंत्रिका ऊतक ^एक और cardiomyocytes ² में intracellular कैल्शियम यात्रियों में कार्रवाई क्षमता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है। अवरक्त प्रकाश के उपयोग के कारण संभावित महीन स्थानिक संकल्प, तंत्रिका कृत्रिम अंग में अनुप्रयोगों के लिए महान ब्याज उठाया गया है, आनुवंशिक रूप से करने के लिए प्रत्यक्ष ऊतक के साथ संपर्क, उत्तेजना कलाकृतियों के न्यूनतम, और जरूरत को हटाने की कमी (उत्तेजना के लिए पहले कोशिकाओं को संशोधित ) optogenetics में आवश्यकता के रूप में ^एक। इन लाभों के सब होने के बावजूद, हाल ही में विकसित थर्मल मॉडल लक्ष्य ऊतक / कोशिकाएं कई प्रोत्साहन साइटों और / या उच्च पुनरावृत्ति दरों ^3,4 उपयोग किया जाता है जब संचयी हीटिंग प्रभाव से प्रभावित किया जा सकता है कि सुझाव दिया।

इन चुनौतियों के जवाब में, शोधकर्ताओं ने बाह्य absor का उपयोग करने की क्षमता को मान्यता दी हैतंत्रिका उत्तेजना के लिए सदस्यों के ऊतकों में अधिक स्थानीय हीटिंग प्रभाव उत्पन्न करने के लिए। हुआंग एट अल। दूर से एक रेडियो आवृत्ति चुंबकीय क्षेत्र के साथ ⁵ HEK 293 कोशिकाओं में तापमान के प्रति संवेदनशील TRPV1 चैनलों को सक्रिय करने के superparamagnetic फेराइट नैनोकणों का उपयोग करके इस सिद्धांत का प्रदर्शन किया। इस तकनीक (चुंबकीय क्षेत्र ऊतक के साथ अपेक्षाकृत कमजोर बातचीत) गहरी पैठ के लिए अनुमति दे सकता है, प्रतिक्रियाओं का ही नहीं बल्कि बायोनिक उपकरणों ⁵ में आवश्यक मिलीसेकंड durations के तुलना में, सेकंड की अवधि में दर्ज किए गए। इन विट्रो में काला सूक्ष्म कणों के साथ चूहे cortical न्यूरॉन्स की इसी तरह, फराह एट अल। प्रदर्शन किया बिजली की उत्तेजना। वे संभावित तेजी से पुनरावृत्ति दरों ⁶ के लिए अनुमति देता है, μJ की रेंज में μs और ऊर्जा के सैकड़ों के आदेश पर नब्ज durations का उपयोग कर उत्तेजना में सेल-स्तर परिशुद्धता दिखाया।

बाह्य अवशोषक का उपयोग भी प्रेरित करने के लिए लागू किया गया हैइन विट्रो में morphological परिवर्तन। Ciofani एट अल। अल्ट्रासाउंड ⁷ से उत्साहित पीजोइलेक्ट्रिक बोरान नाइट्राइड नैनोट्यूब का उपयोग कर neuronal सेल परिणाम में एक ~ 40% वृद्धि देखी गई। इसी तरह, PC12 कोशिकाओं में endocytosed लोहे के आक्साइड नैनोकणों के कारण लोहे के आक्साइड ⁸ के साथ सेल आसंजन अणुओं की सक्रियता के लिए, एक खुराक पर निर्भर तरीके से neurite भेदभाव को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है।

हाल ही में, तंत्रिका उत्तेजना की सहायता के लिए बाह्य अवशोषक में ब्याज भी सोने के नैनोकणों के उपयोग (एयू एनपीएस) पर ध्यान केंद्रित किया है। एयू एनपीएस कुशलतापूर्वक plasmonic चरम पर लेजर प्रकाश को अवशोषित करने के लिए और गर्मी ⁹ के रूप में आसपास के वातावरण में फैलने की क्षमता है। – ¹⁰ उपलब्ध कण आकार के सभी के बीच, सोने nanorods की ऑप्टिकल अवशोषण (एयू एनआरएस) सुविधा (निर, 750-1,400 एनएम के बीच तरंगदैर्ध्य अवरक्त के पास) जैविक ऊतकों की चिकित्सीय खिड़की से मेल खाता है। इसके अलावा, शेष भाग मेंतंत्रिका उत्तेजना की, ext एयू एनआरएस के उपयोग अपेक्षाकृत अनुकूल biocompatibility और सतह functionalization विकल्पों में ¹¹ की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध कराता है। हाल के अध्ययनों से भेदभाव पर एक उत्तेजक प्रभाव NG108-15 neuronal कोशिकाओं ¹² में एयू एनआरएस के सतत लेजर जोखिम के बाद प्रेरित किया जा सकता है कि पता चला है। इसी तरह, intracellular कैल्शियम यात्रियों चर आवृत्तियों और नाड़ी के साथ संग्राहक लेजर विकिरण ¹³ लंबाई के बाद एयू एनआरएस साथ सुसंस्कृत neuronal कोशिकाओं में दर्ज किए गए। कोशिका झिल्ली विध्रुवण भी सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स ¹⁴ के प्राथमिक संस्कृतियों में एयू एनआरएस के NIR से लेजर रोशनी के बाद दर्ज की गई थी। विकिरणित एयू एनआरएस साथ विवो आवेदन में पहली अभी हाल ही में प्रदर्शित किया गया है। EOM और सहकर्मियों उनके plasmonic चरम पर एयू एनआरएस अवगत कराया और यौगिक तंत्रिका कार्रवाई क्षमता (CNAPs) के आयाम में छह गुना वृद्धि हुई है और चूहे sciatic नसों में उत्तेजना दहलीज में तीन गुना कमी दर्ज की गई। एनhanced प्रतिक्रिया एन.आर. plasmonic शिखर ¹⁵ की उत्तेजना से उत्पन्न स्थानीय हीटिंग प्रभाव के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था।

वर्तमान में कागज, एयू एनआरएस साथ सुसंस्कृत NG108-15 neuronal कोशिकाओं में लेजर उत्तेजना के प्रभाव की जांच के लिए प्रोटोकॉल निर्दिष्ट कर रहे हैं। इन विधियों मानक जैविक तकनीक और सामग्री का उपयोग इन विट्रो में सेल आबादी चमकाना करने के लिए एक सरल, अभी तक शक्तिशाली, जिस तरह से प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल सुरक्षित संचालन और repeatable संरेखण की अनुमति देता है कि एक फाइबर युग्मित लेजर डायोड (एलडी) पर आधारित है। एयू एन.आर. नमूना तैयार करने और लेजर विकिरण के तरीकों आगे विशिष्ट संश्लेषण और संस्कृति प्रोटोकॉल क्रमशः, जाना जाता है प्रदान करने, अलग कण आकार और neuronal सेल संस्कृतियों के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Protocol

1. एयू एनआरएस तैयारी नोट: एयू एनआरएस व्यंजनों 16 के एक नंबर के द्वारा संश्लेषित, या वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है। यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से, 0.5-2 एनएम के एक संकल…

Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल 1, 2, और 3 का उपयोग करके, भेदभाव पर एक उत्तेजक प्रभाव एयू एनपीएस के साथ सुसंस्कृत NG108-15 neuronal कोशिकाओं में मनाया गया लेजर के बाद (एयू एनआरएस, पाली (styrenesulfonate) एयू एनआरएस और सिलिका लेपित एयू एनआर…

Discussion

इस प्रस्तुति में उल्लिखित प्रोटोकॉल संस्कृति के लिए, अंतर और ऑप्टिकली बाह्य अवशोषक का उपयोग कर neuronal कोशिकाओं को उत्तेजित वर्णन कैसे। एनआर विशेषताओं (जैसे आयाम, आकार, plasmon अनुनाद तरंगदैर्ध्य और सतह के…

Materials

Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	D6546
FCS	Life Technologies	10100147
L-glutamine	Sigma Aldrich	G7513
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122
Amphotericin B	Life Technologies	15290018
Formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775
Triton X-100	BDH	T8532
BSA	Sigma Aldrich	A2058
Anti-βIII-tubulin	Promega	G7121
TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody	Sigma Aldrich	T5393
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
DMSO	Sigma Aldrich	472301
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
Equipment name	Company	Catalogue Number
UV-Vis spectrometer	Varian Medical Systems Inc.	Cary 50 Bio
Mini centrifuge	Eppendorf	Mini Spin
Sonic bath	Unisonics Australia	FPX 10D
Cell culture incubator	Kendro	Hera Cell 150
Cell culture centrifuge	Hettich	Rotofix 32A
Laser diode	Optotech	780 nm single mode fibre – coupled LD
Optical fiber	Thorlabs	780 HP
Power meter	Coherent	Laser Check
ImageJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Epifluorescent microscope	Axon Instruments	ImageX-press 5000A
μ-slide well	Ibidi	80826
Inverted confocal microscope	Carl Zeiss Microscopy Ltd.	LSM 510 meta-confocal microscope
Oscilloscope	Tektronix	TDS210