דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

Summary

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Abstract

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

Introduction

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף. זה יוצר חיץ בין הסביבה החיצונית והאיברים הפנימיים. יתר על כן, העור מגן על הגוף מפני אובדן נוזלים, השפעות סביבתיות, פציעות ודלקות ומסייע בויסות טמפרטורת גוף ^1. בשל מיקומו החשוף, העור מושפע לעתים קרובות על ידי טראומה מכאנית, תרמית או כימית. למרות העור הוא בדרך כלל מסוגל תיקון עצמי, גורמים רבים מקומיים כגון זיהום, חמצון, והסתפקות ורידים יכולים להוביל לריפוי פצעים לקוי. ריפוי פצע יכול להיות גם הפריע ידי גורמים מערכתיים כמו השמנת יתר, אלכוהוליזם, עישון, תרופות, תזונה ומחלות כמו סוכרת. ²

התהליך של ריפוי פצע יכול להיות מחולק לשלבים 3: (i) השלב הדלקתי, (ii) השגשוג ו( iii) שלב שיפוץ. על פגיעה בעור, אות-מפל מורכב מתחיל, שהוביל לסגירת הפצע. ³לאחר פציעה, הפצע מדמם וקריש דם נוצר. Fibroblasts לעבור לקריש הדם ולהחליף אותו עם רקמה חדשה ששופצה לאחר מכן במשך שנים.

ההבנה הנוכחית של תיקון עורית תהליכים ביולוגיים הבסיסי היא מוגבלת. מודלים של בעלי חיים וחזיר קטנים ששמשו ללמוד ריפוי פצע. עם זאת, תוצאות אלה לא יכולים להיות מועברות ישירות לבני אדם בשל הבדלי מינים ספציפיים. בנוסף לדגמים אלה in vivo, כמה היבטים של ריפוי פצע ניתן ללמוד על ידי הדמיה של מצב פצע באמצעות גירוד של תרבויות monolayer במבחנה המבוסס על שורות תאים הונצחו או תאים ראשוניים. ⁴ דגמים מגרדים אלה טופל מאוד אבל לא מספיק משקפים את פיזיולוגיה מורכבת in vivo. ⁵ מלבד דגמים דו-ממדיים, שווה עור אנושי תלת ממדים פותחו עבור מחקר דרמטולוגיים. חלק עורי של מודלים אלה הם generated באמצעות פיגומים שונים, כולל הדרמיס decellularized, ⁶ הידרוג קולגן, ^7,8 glycosaminoglycans ⁹ או חומרים סינטטיים. ¹⁰ העסקת שווה עור אלה, התפקיד של אינטראקציות אפיתל-mesenchymal ^11, epithelialization מחדש, crosstalk הסלולרי בין fibroblasts וקרטינוציטים ו השפעה של גורמי גדילה שונים ניתן ללמוד. יתר על כן, מודלים אלה הם שימושיים כדי לצבור ידע חדש על איך fibroblasts להעביר לאזור הפצוע ואיך chemotactic גורמים משפיעים התחדשות רקמות. ¹²

לא רק הדור של מודל ריפוי הפצע עצמו הוא מאתגר, אלא גם להקים פצע סטנדרטי מאוד במודל הוא בעייתי. טכניקות נפוצות ליצירת פצעי בדיקות מאפס, ¹³ כוויות, שחיקה קלטת ^{14, 15} פגיעת תרמית, ¹⁶ שלפוחיות יניקה, חנקן נוזלי ^{17, 18} לייזרים, ¹⁹ </sup> אזמלים, ¹⁸ meshers ⁶ ואגרופי ביופסיה. ²⁰ רוב השיטות אלה יש את אותו חסרונות. פציעות מיושמות באופן ידני קשות כדי לתקנן ולהתרבות בין בדיקות מרובות. גודל, צורה ועומק של הפצע משתנים בין מחקרים ובכך לפגוע באיכות של נתוני מחקר. השימוש בליזר לפציעת עור מוגדר יכול להיות סטנדרטי בקלות יחסית, אך מוביל למצב מחקה פצעי כוויות. חום מיושם על ידי לייזר יכול לגרום denaturation החלבון, צבירת טסיות דם או כלי התכווצות, מה שעלול להוביל לרקמות נמקית.

בגישה חלופית, שפיתחנו מכשיר אוטומטי פציעה (AWD), אשר מאפשר לנו ליצור פצעי cutaneous מוגדרים ומדויקים בתנאים סטריליים. פרמטרים פצעו, כמו עומק ומהירות של חדירה, כמו גם מהפכות של ראש המקדח יכולים להיות מוסדרים. במחקר זה, אנחנו בשילוב עם AWD שווה עור בעובי מלא בבית פיתח (ftSE) שניתן להשוואה לפרוטוקול שפורסם על ידי et al Gangatirkar. ⁸ שכבת הדרמיס של העור שווה הערך מורכב מfibroblasts האנושי עורי (HDF), ששובצו בקולגן אני הידרוג'ל. בשכבת הדרמיס, קרטינוציטים אדם אפידרמיס (HEK) הם זורעים. בתוך שבועיים בממשק האוויר הנוזלי HEK לבנות את האפידרמיס מורכב מכמה שכבות תאים חיוניות ושכבה קרנית. חוץ מזה הדור של מודל זה, מחקר זה מציג את השימוש של AWD כדי ליצור פצעים מוגדרים ומדויקים בFTSE.

Protocol

הערה: הפרוטוקול מיועד לייצור של 24 שווי עור בעובי מלא. אדם fibroblasts עורי וקרטינוציטים אפידרמיס בודדו מביופסיות עור על פי פרוטוקול שפורסם בעבר. 21,22 הסכמה מדעת הושגה מראש והמחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המוסד במחקר אנושי של יוליוס-מקסימיליאן-האוניברסיטה וורצבורג (1…

Representative Results

HDF המבודד וHEK שונה הן במורפולוגיה ובביטוי של סמנים אופייניים. HDF הראה מורפולוגיה ציר בצורה אופיינית, ואילו מורפולוגיה של HEK יכולה להיות מתוארת על ידי מורפולוגיה מרוצפת. התאים התאפיינו במכתים immunohistochemical (איור 1) לפני השימוש בהם לFTSE. HDF הם חיובי עבור vimentin (איו…

Discussion

בתאים במבחנה, בדרך כלל, הרחיבו בתרביות תאים הדו-ממדי, שבו תאים לדבוק משטחי פלסטיק. עם זאת, תנאי התרבות אלה אינם משקפים את התנאים תלת ממדים הפיסיולוגיים שבו תאים לגדול in vivo. בתנאים תלת-ממדיים, תאים יכולים ליצור קבצים מצורפים תא-תא ותא-מטריצה ​​טבעיות ולהעביר ?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS	PAA	L11-003	0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid)	Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
6 well plate	Nunc	140685
24 well plate	Nunc	142485
Microscope slides	R. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten culture medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7,5 ml)
Skin model submers medium (500ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Fetal calf serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
CK14 antibody	Sigma	HPA023040-100µl
CK10 antibody	Dako	M7002
Filaggrin antibody	Abcam	ab81468
H&E staining
Mayer´s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Mounting Medium	Sigma Aldrich	M1289-10ML